本文關(guān)鍵詞：RNA結(jié)合蛋白HuR對乳腺癌細(xì)胞中PDGFC的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： RNA結(jié)合蛋白 HuR 乳腺癌 PDGFC 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

【摘要】：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首,死亡率僅次于肺癌,就診時大部分患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移,成為女性的“頭號殺手”。乳腺癌發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的過程,其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,但相關(guān)信號通路紊亂以及多基因表達(dá)失調(diào)是重要原因,因此研究乳腺癌演變過程中的基因表達(dá),對于乳腺癌的診治具有非常重要的理論意義和臨床價值。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF),其家族主要由PDGFA、B、C、D四個成員組成,它們通過形成異源二聚體或者自身相互作用,從而產(chǎn)生五種形式,即PDGF-AA、-AB、-BB、-CC和-DD。PDGF受體PDGFR-α和PDGFR-β在腫瘤細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞中具有大量表達(dá),當(dāng)PDGF和其受體PDGFR-α、PDGFR-β結(jié)合時,能夠激活下游信號,發(fā)揮其生物學(xué)功能。血小板衍生生長因子C(PDGFC)屬于PDGF家族新成員,在多種組織細(xì)胞大量表達(dá),包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中亦廣泛表達(dá),最早發(fā)現(xiàn)于血小板α顆粒。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞成纖維細(xì)胞能夠大量表達(dá)其受體,活化的受體通過激活酪氨酸激酶通路介導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化,參與多種細(xì)胞因子的分泌以及腫瘤微環(huán)境的形成,有關(guān)PDGFC在腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中的作用機(jī)制研究相對較少。目前研究發(fā)現(xiàn)PDGFC在促進(jìn)血管生成方面具有重要作用,過表達(dá)的PDGFC促進(jìn)血管異�；�,其表達(dá)在乳腺癌起始、發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著顯著作用。乳腺腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)PDGFC表達(dá)的具體機(jī)制尚未清楚,深入探討其調(diào)節(jié)機(jī)制,是認(rèn)識乳腺癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。人抗原R(human antigen R,Hu R)屬于胚胎致死性異常視覺(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)基因家族成員,ELAV家族主要成員包括Hu R、Hu B、Hu C及Hu D四種,在細(xì)胞中,它們主要通過基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Hu R是ELAVL家族中研究的最為充分的m RNA結(jié)合蛋白,在機(jī)體組織細(xì)胞中廣泛表達(dá),主要定位于細(xì)胞核,在缺氧、炎性細(xì)胞因子等因素刺激下,其細(xì)胞質(zhì)表達(dá)明顯增高。近年來研究表明,Hu R蛋白是免疫細(xì)胞激活、肌肉分化、細(xì)胞分裂衰老等生命活動的重要調(diào)節(jié)基因,在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中高度活化。乳腺癌細(xì)胞中Hu R的過表達(dá)與腫瘤大小,組織分化及生存率等密切相關(guān),我們的前期研究也表明,Hu R能夠增強(qiáng)Snail的表達(dá),促進(jìn)乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移。所有這些高度提示,Hu R有可能調(diào)節(jié)一些下游靶基因,通過一種自分泌或旁分泌的方式參與乳腺腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。那么,在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中,Hu R是否調(diào)節(jié)PDGFC的表達(dá)?調(diào)節(jié)機(jī)制又是怎樣呢?這是本研究所要解決的問題。越來越多的研究表明,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是通過某種RNA結(jié)合蛋白及mi RNA等介導(dǎo)實現(xiàn)的。在基因的表達(dá)調(diào)控中,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作為一種精細(xì)的調(diào)控模式在基因的表達(dá)以及細(xì)胞命運的決定中起著重要的作用。RNA結(jié)合蛋白Hu R通過與靶基因m RNA結(jié)合,在m RNA的加工、修飾、穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用,最終導(dǎo)致靶基因相關(guān)的生物學(xué)功能異常。本研究著眼于探討PDGFC的調(diào)控機(jī)制。結(jié)合文獻(xiàn)并通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)PDGFC的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)具有Hu R的結(jié)合位點,提示PDGFC可能是Hu R調(diào)控的靶基因并受其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)�；谝陨霞僭O(shè),通過實時定量PCR、Western blot、RNA-IP、報告基因系統(tǒng)等實驗明確了Hu R對PDGFC的分子調(diào)控機(jī)制,并進(jìn)一步探討了PDGFC在乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用。本研究取得以下初步結(jié)論:1.PDGFC在乳腺癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),并與患者預(yù)后及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)。2.乳腺癌細(xì)胞中PDGFC和Hu R表達(dá)呈正相關(guān)。PDGFC的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),PDGFC 3’UTR存在Hu R的結(jié)合位點。3.Hu R通過與PDGFC m RNA 3’UTR結(jié)合上調(diào)PDGFC的表達(dá)。4.乳腺癌中應(yīng)激誘導(dǎo)Hu R上調(diào)PDGFC。H2O2活化和紫外線(UV)照射乳腺癌細(xì)胞,誘導(dǎo)Hu R表達(dá),從而上調(diào)PDGFC。綜上所述,本課題組首次發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中PDGFC和Hu R表達(dá)的相關(guān)性,深入探討其調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn),Hu R通過與PDGFC 3’UTR結(jié)合上調(diào)PDGFC,進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究揭示了Hu R在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)PDGFC的分子機(jī)制,為乳腺癌的臨床診斷和治療提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：RNA結(jié)合蛋白 HuR 乳腺癌 PDGFC 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-24
• 乳腺癌概況16-17
• 一、乳腺癌的發(fā)病特點16
• 二、乳腺癌的診斷和治療16-17
• PDGF 相關(guān)研究17-19
• 一、PDGF 及其受體17-18
• 二、PDGF 基本結(jié)構(gòu)18-19
• 三、PDGF 生物學(xué)作用19
• PDGFC 相關(guān)研究19-21
• 一、PDGFC 及其受體19-20
• 二、PDGFC 變體20
• 三、PDGFC 生物學(xué)作用20-21
• HuR 相關(guān)研究21-23
• 一、Hu R 基本情況21-22
• 二、Hu R 作用機(jī)制22
• 三、Hu R 與腫瘤關(guān)系22-23
• 小結(jié)23-24
• 實驗一 PDGFC在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)24-37
• 1 材料、試劑和儀器24-26
• 1.1 實驗材料24-25
• 1.2 主要試劑和儀器25-26
• 2 方法26-31
• 2.1 PDGFC免疫組織化學(xué)檢測26-27
• 2.2 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)27
• 2.3 蛋白印跡法（Western blot）27-29
• 2.4 si RNA（PDGFC）轉(zhuǎn)染29
• 2.5 MTT實驗29-30
• 2.6 侵襲實驗30
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)方法30-31
• 3 結(jié)果31-35
• 3.1 PDGFC在乳腺癌組織中的表達(dá)31-34
• 3.2 PDGFC在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)34-35
• 3.3 PDGFC表達(dá)下調(diào)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲的影響35
• 4 討論35-37
• 實驗二 乳腺癌細(xì)胞中PDGFC和Hu R表達(dá)的相關(guān)性37-43
• 1 材料、試劑和儀器37-38
• 1.1 實驗材料37
• 1.2 主要試劑和儀器37-38
• 2 方法38-40
• 2.1 PDGFC啟動子活性分析38-39
• 2.2 PDGFC 3’UTR活性分析39
• 2.3 預(yù)測PDGFC 3’UTR的Hu R結(jié)合位點39
• 2.4 Hu R免疫組織化學(xué)檢測39-40
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)方法40
• 3 結(jié)果40-42
• 3.1 不同乳腺癌細(xì)胞系PDGFC啟動子和PDGFC 3’UTR報告基因活性檢測40-41
• 3.2 預(yù)測PDGFC 3’UTR的Hu R結(jié)合位點41
• 3.3 Hu R在乳腺癌組織中的表達(dá)41-42
• 4 討論42-43
• 實驗三 乳腺癌細(xì)胞中Hu R調(diào)控PDGFC的分子機(jī)制43-51
• 1 材料、試劑和儀器43-44
• 1.1 實驗材料43
• 1.2 主要試劑和儀器43-44
• 2 方法44-47
• 2.1 Western blot檢測不同乳腺癌細(xì)胞系中Hu R和PDGFC的表達(dá)44
• 2.2 si RNA(Hu R)轉(zhuǎn)染44-45
• 2.3 RNA提取及定量45
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄45
• 2.5 實時定量PCR45-46
• 2.6 RNA免疫共沉淀(RNA-IP)46
• 2.7 截短PDGFC 3’UTR和si-Hu R2干預(yù)后，報告基因活性檢測46-47
• 3 結(jié)果47-49
• 3.1 PDGFC和Hu R在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)47
• 3.2 si RNA對乳腺癌細(xì)胞Hu R表達(dá)的影響47-48
• 3.3 實時定量PCR分析si-Hu R2干擾PDGFC的表達(dá)48
• 3.4 RNA-IP證實Hu R與PDGFC m RNA的直接相互作用48-49
• 3.5 PDGFC m RNA 3’UTR報告基因系統(tǒng)檢測49
• 4 討論49-51
• 實驗四 乳腺癌中應(yīng)激誘導(dǎo)Hu R調(diào)控PDGFC51-56
• 1 材料、試劑和儀器51-52
• 1.1 實驗材料51
• 1.2 主要試劑和儀器51-52
• 2 方法52-53
• 2.1 Western blot檢測經(jīng)H2O2活化后MCF-7 細(xì)胞中Hu R和PDGFC的表達(dá)52
• 2.2 Western blot檢測經(jīng)紫外線照射后MCF-7 細(xì)胞中Hu R的表達(dá)52
• 2.3 ELISA檢測經(jīng)紫外線照射后MCF-7 細(xì)胞中PDGFC的表達(dá)52
• 2.4 MCF-7 細(xì)胞活性檢測（MTT實驗）52-53
• 3 結(jié)果53-54
• 3.1 H2O2誘導(dǎo)Hu R上調(diào)PDGFC53
• 3.2 紫外線誘導(dǎo)Hu R上調(diào)PDGFC53-54
• 3.3 不同處理條件對MCF-7 細(xì)胞活性的影響54
• 4 討論54-56
• 小結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-74
• 個人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75

【相似文獻(xiàn)】

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