本文關鍵詞：自噬調控對JAK2 V617F陽性HEL細胞及真性紅細胞增多癥患者造血細胞增殖的影響

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【摘要】：目的:通過檢測JAK2 V617F陽性HEL細胞及真性紅細胞增多癥(PV)患者造血細胞自噬水平,探索自噬調控對HEL細胞及PV患者造血細胞增殖的影響。方法:1.檢測JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬活性:應用流式細胞術及吖啶橙(AO)染色法檢測HEL細胞內LC3-蛋白的表達,以JAK2 V617F陰性K562細胞為對照;2.誘導或抑制JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬后檢測細胞內LC3-Π蛋白的表達:自噬誘導劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于HEL細胞48h后,流式細胞術和吖啶橙(AO)染色法檢測HEL細胞內LC3-Π蛋白的表達。3.誘導或抑制JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力:自噬誘導劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于HEL細胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力。4.檢測JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞自噬活性:采集12例臨床上確診的JAK2 V617F陽性PV患者外周血,以15例健康體檢者外周血為對照,流式細胞術和Western blot法檢測JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達。5.誘導或抑制自噬后檢測JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達:自噬誘導劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞48h后,流式細胞術和Western blot法檢測細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達。6.誘導或抑制JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力:自噬誘導劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力。結果:1.LC3-Ⅱ蛋白在HEL細胞內的表達水平流式細胞術檢測HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白的平均熒光強度值明顯高于JAK2 V617F陰性K562細胞,分別為(159388.67±29001.10)、(96046.67±24134.08)(P㩳0.05);AO染色熒光顯微鏡觀察HEL細胞內自噬體形成明顯高于K562細胞。2.自噬活性改變后JAK2 V617F陽性HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達流式細胞術檢測結果顯示對照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組細胞內LC3-II蛋白的平均熒光強度值分別為(95533.33±4273.56)、(268333.30±33560.89)、(20000.00±7285.60)(P㩳0.05)。3.自噬活性改變對JAK2 V617F陽性HEL細胞增殖活力的影響HEL細胞常規(guī)培養(yǎng),于12h、24h、48h各時間點檢測細胞活力,細胞呈增殖狀態(tài);自噬誘導劑雷帕霉素作用于HEL細胞12h、24h、48h后,各時間點檢測細胞增殖活力較對照組對應各時間點明顯增強(P㩳0.05);而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤作用于HEL細胞,于12h、24h、48h各時間點觀察細胞增殖活力較對照組對應各時間點明顯降低(P㩳0.05),48h時雷帕霉素處理組(101413.00±3 720.54)、3-MA處理組(5732.00±165.64)細胞增殖活力與對照組(29435.33±971.84)比較差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。4.JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達流式細胞術檢測12例PV患者外周血中髓系細胞內LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度值明顯高于15例健康體檢者外周血髓系細胞,分別為(92841.67±4249.59)、(86633.33±2503.90)(P㩳0.05);Western blot檢測3例PV患者外周血細胞內LC3-II蛋白表達高于健康體檢者。5.誘導或抑制自噬對JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達的影響流式細胞術檢測結果顯示,對照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組髓系細胞內LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度值分別為(75433.33±10920.78)、(98000.00±2475.88)、(48733.33±6978.78),三組差異均有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05);Western blot檢測結果顯示,3-MA處理組骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較對照組明顯降低;雷帕霉素處理組骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較對照組升高。6.自噬活性改變對JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞增殖活力的影響PV患者骨髓細胞常規(guī)培養(yǎng),隨培養(yǎng)時間延長呈增殖趨勢,應用雷帕霉素和3-MA分別誘導和抑制自噬,于0h、12h、24h、48h各時間點觀察細胞增殖活力,結果顯示,雷帕霉素和3-MA對PV患者骨髓細胞分別有促進和抑制細胞增殖的作用,與對照組對應各時間點比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05),48h時對照組、雷帕霉素處理組、3-MA處理組細胞增殖活力分別為(16200.33±680.00)、(18743.67±1015.09)、(5371.00±55.87),差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。結論:1.JAK2 V617F陽性HEL細胞和PV患者造血細胞存在較高的基礎自噬水平:JAK2 V617F陽性HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較JAK2 V617F陰性K562細胞明顯增加;JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達表達明顯高于健康體檢者外周血細胞。2.上調自噬活性可促進JAK2 V617F陽性HEL細胞和PV患者骨髓細胞的增殖;下調自噬活性對JAK2 V617F陽性HEL細胞和PV患者骨髓細胞的增殖有明顯抑制作用。3.自噬異常是真性紅細胞增多癥發(fā)生發(fā)展的病理生理學機制之一,自噬調控可能是PV治療的新靶點。
【關鍵詞】：自噬 真性紅細胞增多癥 JAK2 V617F突變 細胞增殖
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R558.3;R733
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 常用縮寫詞中英文對照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-22
• 1.1 實驗材料15-17
• 1.2 實驗方法17-22
• 2 結果22-29
• 2.1 JAK2 V617F+HEL細胞自噬活性的檢測22-23
• 2.2 自噬調控對JAK2 V617F+HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達的影響23-24
• 2.3 JAK2 V617F+PV患者造血細胞自噬活性的檢測24-25
• 2.4 自噬調控對JAK2 V617F+PV患者骨髓細胞內LC3-Ⅱ表達的影響25-26
• 2.5 自噬活性改變對JAK2 V617F+HEL細胞增殖活力的影響26-27
• 2.6 自噬活性改變對JAK2 V617F+PV患者骨髓細胞增殖活力的影響27-29
• 3 討論29-32
• 4 結論32-33
• 參考文獻33-35
• 綜述35-48
• 參考文獻43-48
• 致謝48-49
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果49-50
• 個人簡歷50

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