本文關(guān)鍵詞：自噬調(diào)控對(duì)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞及真性紅細(xì)胞增多癥患者造血細(xì)胞增殖的影響

  更多相關(guān)文章： 自噬 真性紅細(xì)胞增多癥 JAK2 V617F突變 細(xì)胞增殖

【摘要】：目的:通過(guò)檢測(cè)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞及真性紅細(xì)胞增多癥(PV)患者造血細(xì)胞自噬水平,探索自噬調(diào)控對(duì)HEL細(xì)胞及PV患者造血細(xì)胞增殖的影響。方法:1.檢測(cè)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞自噬活性:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及吖啶橙(AO)染色法檢測(cè)HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-蛋白的表達(dá),以JAK2 V617F陰性K562細(xì)胞為對(duì)照;2.誘導(dǎo)或抑制JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞自噬后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Π蛋白的表達(dá):自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于HEL細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙(AO)染色法檢測(cè)HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-Π蛋白的表達(dá)。3.誘導(dǎo)或抑制JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力:自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于HEL細(xì)胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。4.檢測(cè)JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者外周血細(xì)胞自噬活性:采集12例臨床上確診的JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者外周血,以15例健康體檢者外周血為對(duì)照,流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者外周血細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)。5.誘導(dǎo)或抑制自噬后檢測(cè)JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá):自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)。6.誘導(dǎo)或抑制JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力:自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(終濃度為10μmol/L)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(終濃度10mmol/L)分別作用于JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。結(jié)果:1.LC3-Ⅱ蛋白在HEL細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的平均熒光強(qiáng)度值明顯高于JAK2 V617F陰性K562細(xì)胞,分別為(159388.67±29001.10)、(96046.67±24134.08)(P㩳0.05);AO染色熒光顯微鏡觀察HEL細(xì)胞內(nèi)自噬體形成明顯高于K562細(xì)胞。2.自噬活性改變后JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組細(xì)胞內(nèi)LC3-II蛋白的平均熒光強(qiáng)度值分別為(95533.33±4273.56)、(268333.30±33560.89)、(20000.00±7285.60)(P㩳0.05)。3.自噬活性改變對(duì)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞增殖活力的影響HEL細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),于12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活力,細(xì)胞呈增殖狀態(tài);自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作用于HEL細(xì)胞12h、24h、48h后,各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯增強(qiáng)(P㩳0.05);而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤作用于HEL細(xì)胞,于12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯降低(P㩳0.05),48h時(shí)雷帕霉素處理組(101413.00±3 720.54)、3-MA處理組(5732.00±165.64)細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組(29435.33±971.84)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。4.JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者外周血細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)12例PV患者外周血中髓系細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強(qiáng)度值明顯高于15例健康體檢者外周血髓系細(xì)胞,分別為(92841.67±4249.59)、(86633.33±2503.90)(P㩳0.05);Western blot檢測(cè)3例PV患者外周血細(xì)胞內(nèi)LC3-II蛋白表達(dá)高于健康體檢者。5.誘導(dǎo)或抑制自噬對(duì)JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組髓系細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強(qiáng)度值分別為(75433.33±10920.78)、(98000.00±2475.88)、(48733.33±6978.78),三組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05);Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,3-MA處理組骨髓細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低;雷帕霉素處理組骨髓細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高。6.自噬活性改變對(duì)JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者骨髓細(xì)胞增殖活力的影響PV患者骨髓細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈增殖趨勢(shì),應(yīng)用雷帕霉素和3-MA分別誘導(dǎo)和抑制自噬,于0h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞增殖活力,結(jié)果顯示,雷帕霉素和3-MA對(duì)PV患者骨髓細(xì)胞分別有促進(jìn)和抑制細(xì)胞增殖的作用,與對(duì)照組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05),48h時(shí)對(duì)照組、雷帕霉素處理組、3-MA處理組細(xì)胞增殖活力分別為(16200.33±680.00)、(18743.67±1015.09)、(5371.00±55.87),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:1.JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞和PV患者造血細(xì)胞存在較高的基礎(chǔ)自噬水平:JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較JAK2 V617F陰性K562細(xì)胞明顯增加;JAK2 V617F陽(yáng)性PV患者外周血細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)表達(dá)明顯高于健康體檢者外周血細(xì)胞。2.上調(diào)自噬活性可促進(jìn)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞和PV患者骨髓細(xì)胞的增殖;下調(diào)自噬活性對(duì)JAK2 V617F陽(yáng)性HEL細(xì)胞和PV患者骨髓細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。3.自噬異常是真性紅細(xì)胞增多癥發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制之一,自噬調(diào)控可能是PV治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 真性紅細(xì)胞增多癥 JAK2 V617F突變 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R558.3;R733
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 常用縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2 結(jié)果22-29
• 2.1 JAK2 V617F+HEL細(xì)胞自噬活性的檢測(cè)22-23
• 2.2 自噬調(diào)控對(duì)JAK2 V617F+HEL細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響23-24
• 2.3 JAK2 V617F+PV患者造血細(xì)胞自噬活性的檢測(cè)24-25
• 2.4 自噬調(diào)控對(duì)JAK2 V617F+PV患者骨髓細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達(dá)的影響25-26
• 2.5 自噬活性改變對(duì)JAK2 V617F+HEL細(xì)胞增殖活力的影響26-27
• 2.6 自噬活性改變對(duì)JAK2 V617F+PV患者骨髓細(xì)胞增殖活力的影響27-29
• 3 討論29-32
• 4 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-35
• 綜述35-48
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 致謝48-49
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果49-50
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷50

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本文編號(hào)：1107914