本文關(guān)鍵詞：AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導的細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的研究

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【摘要】：目的紫杉醇作為一線化療藥物被廣泛應用于多種類型癌癥的治療。但最新的研究表明,持續(xù)的紫杉醇治療,有可能會導致腫瘤的擴散和外滲。Micro RNAs在促進腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期運用mi R-21反義寡核苷酸聯(lián)合低劑量紫杉醇可有效提高藥物的治療效果。本研究主要探討紫杉醇誘導腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制,以及運用mi R-21小分子抑制劑--AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇對提高化療藥效和細胞轉(zhuǎn)移的影響和相關(guān)的分子機制。方法1.根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫,分析正常組織和腫瘤組織中mi R-21和CDK5的表達水平。利用原位雜交和免疫組化分別檢測58對有無淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中mi R-21和CDK5的表達水平,研究mi R-21和CDK5的表達模式與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。2.采用乳腺癌細胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87VIII,實驗分別設置為細胞對照組(control組)、低劑量紫杉醇組(0.5μM)和高劑量紫杉醇組(2μM)。Western blot檢測各組中E-cadherin、β-catenin、vimentin和CDK5的表達情況。Real-time PCR檢測各組中mi R-21的表達水平。3.采用乳腺癌細胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87VIII,實驗分別設為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組。免疫熒光檢測侵襲偽足的數(shù)目。Transwell和Wound Healing Assay分別檢測細胞的侵襲和遷移能力。4.采用乳腺癌細胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87VIII,mi R-21小分子抑制劑AC1MMYR2處理細胞24 h,RNA測序分析、GO分析及KEGG分析這個過程中mi R-21下游的靶基因。采用上述兩種細胞系,實驗設置為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組,Western blot檢測各組中CDK5、CDK5RAP1和p-FAKSer732的表達水平。采用上述兩種細胞系,轉(zhuǎn)染sh CDK5的慢病毒或CDK5過表達質(zhì)粒,建立CDK5敲除和過表達的細胞系。實驗設置為control組、紫杉醇組和紫杉醇+AC1MMYR2組,Western blot檢測3種細胞系中E-cadherin、β-catenin和vimentin的表達水平。采用人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87VIII,實驗設置為control組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組,免疫熒光檢測E-cadherin、N-cadherin、β-catenin及Tubulin-α的表達情況和亞細胞定位。5.采用乳腺癌細胞系MDA-MB-231和人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87VIII,實驗分為control組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組,Western blot檢測CDK5RAP1、Egr-1和p39的表達水平。采用上述兩種細胞系,實驗分為control組、Ig G組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組,免疫共沉淀研究p39和CDK5之間的相互作用。采用上述兩種細胞系,實驗分為control組、AC1MMYR2組和紫杉醇+AC1MMYR2組,免疫熒光檢測p39在細胞內(nèi)的分布,Western blot檢測p39在細胞核和細胞質(zhì)中的表達水平。6.構(gòu)建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型,體內(nèi)研究AC1MMYR2對紫杉醇誘導的腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。5*106轉(zhuǎn)染luciferase慢病毒的MDA-MB-231細胞注射到裸鼠乳腺脂肪墊上,建立裸鼠乳腺癌原位模型,小鼠被隨機分為四組(每組8只):PBS組、紫杉醇組、AC1MMYR2組和聯(lián)合治療組。小動物活體成像檢測腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移的熒光信號。HE染色鑒定是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。免疫組化檢測4種治療組中CDK5和β-catenin的表達情況。結(jié)果1.根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,mi R-21和CDK5在腫瘤組織中都是高表達的,且其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。原位雜交實驗發(fā)現(xiàn),與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織相比,轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中mi R-21的熒光強度明顯增強。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),在39例侵襲性乳腺癌組織中全部檢測到CDK5的表達,但是在19例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中,只有7例檢測到CDK5的表達。2.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與control組相比,低劑量紫杉醇組中E-cadherin的表達水平升高,β-catenin、vimentin和CDK5的表達水平顯著降低;高劑量紫杉醇組中E-cadherin的表達水平顯著降低,而β-catenin、vimentin和CDK5的表達水平顯著增加(P0.05)。此外,Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),低劑量紫杉醇組中mi R-21的表達水平明顯降低,而高劑量紫杉醇組中mi R-21的表達水平明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.免疫熒光顯示,與control組相比,紫杉醇顯著增加了MDA-MB-231和U87VIII細胞中侵襲偽足的數(shù)目,MDA-MB-231細胞中幾乎增加了2~3倍,AC1MMYR2處理后顯著降低了MDA-MB-231和U8VIII細胞形成侵襲偽足的能力;與紫杉醇處理組相比,紫杉醇+AC1MMYR2組中只形成了很少量的侵襲偽足。Transwell實驗顯示,與control組相比,紫杉醇顯著增加了侵襲細胞的數(shù)目(P0.05),AC1MMYR2處理組中侵襲細胞的數(shù)目明顯降低;與紫杉醇處理組相比,紫杉醇+AC1MMYR2處理組中侵襲細胞的數(shù)目降低大約45%~55%。Wound Healing Assay結(jié)果顯示,與control組相比,紫杉醇促進了兩種細胞的遷移能力,而AC1MMYR2組中細胞的遷移能力受到了抑制;與紫杉醇處理組相比,紫杉醇+AC1MMYR2組中細胞的定向遷移受到了明顯的抑制。4.根據(jù)RNA測序分析、GO分析和KEGG分析,我們發(fā)現(xiàn)只有CDK5RAP1(CDK5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白1)是MDA-MB-231和U87VIII細胞中mi R-21共同的靶基因。Western blot顯示,與control組相比,紫杉醇顯著增加了CDK5及其下游靶p-FAKSer732的表達水平(P0.05);AC1MMYR2和AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇組中這兩種蛋白的表達都明顯減少(P0.05),但CDK5RAP1的表達卻顯著升高(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,sh RNA介導的CDK5的沉默增強了E-cadherin的表達水平,與control組細胞相比,紫杉醇組和聯(lián)合組中間質(zhì)標志物β-catenin和vimentin的表達水平顯著降低;相反,在轉(zhuǎn)染CDK5過表達質(zhì)粒的兩種細胞系中,CDK5的過表達阻斷了AC1MMYR2的作用,AC1MMYR2組和聯(lián)合組中E-cadherin的表達減少(P0.05),β-catenin和vimentin的表達增加(P0.05)。此外,U87VIII細胞的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),與control組相比,紫杉醇處理組中幾乎檢測不到E-cadherin的表達,β-catenin和N-cadherin的熒光強度明顯增強;與紫杉醇處理組相比,聯(lián)合組中E-cadherin的熒光強度增加,β-catenin的熒光強度降低,在細胞核中的分布減少,N-cadherin的熒光強度也降低;此外,與control組相比,紫杉醇處理組中Tubulin-α的熒光強度明顯增強,Tubulin-α變得舒展,聚集在核周;與紫杉醇組相比,AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇組中Tubulin-α的熒光強度明顯降低,Tubulin-α變得卷曲。5.Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,AC1MMYR2和聯(lián)合組中隨著CDK5表達量的降低,CDK5RAP1和Egr-1的表達顯著提高,而p39的表達量卻減少。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),在control組細胞中CDK5與p39相結(jié)合,而AC1MMYR2組和聯(lián)合組中CDK5與p39之間的結(jié)合減少。免疫熒光顯示,與control組相比,AC1MMYR2組和聯(lián)合組中p39的熒光強度降低,p39在細胞核中的分布減少,轉(zhuǎn)位到細胞漿。Western blot發(fā)現(xiàn),與control組相比,細胞漿中p39表達水平降低,細胞質(zhì)中p39表達水平也降低。6.建立MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位模型。小動物活體成像結(jié)果顯示,與control組相比,紫杉醇治療組在一定程度上抑制了腫瘤的生長,AC1MMYR2治療組顯著的抑制了腫瘤的生長;與紫杉醇治療組相比,AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇顯著抑制了腫瘤的生長。治療過程中對腫瘤體積的檢測發(fā)現(xiàn),與control組相比,紫杉醇治療組在一定程度上抑制了腫瘤的生長,AC1MMYR2治療組顯著的抑制了腫瘤的生長;與紫杉醇治療組相比,AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇顯著抑制了腫瘤的生長。肺部生物發(fā)光檢測結(jié)果表明,與control組相比,紫杉醇治療組增加了肺轉(zhuǎn)移,AC1MMYR2治療組沒有肺轉(zhuǎn)移;與紫杉醇治療組相比,AC1MMYR2聯(lián)合紫杉醇治療組顯著抑制了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。HE染色也得到了同樣的結(jié)果。免疫組化發(fā)現(xiàn),與control組相比,紫杉醇治療組中CDK5和β-catenin的表達水平明顯升高,AC1MMYR2組中這兩種蛋白的表達水平顯著降低;與紫杉醇治療組相比,聯(lián)合組中CDK5和β-catenin的表達水平顯著降低。結(jié)論紫杉醇通過激活mi R-21/CDK5信號通路促進細胞轉(zhuǎn)移,mi R-21的小分子抑制劑AC1MMYR2通過抑制mi R-21/CDK5RAP1/CDK5信號通路的活性,逆轉(zhuǎn)紫杉醇藥物誘導的細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,可作為臨床紫杉醇治療的潛在輔助給藥方案,為增強紫杉醇藥物治療效果提供了新的思路和策略。
【關(guān)鍵詞】：AC1MMYR2 紫杉醇 CDK5 CDK5RAP1 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 縮略語16-17
• 前言17-20
• 研究現(xiàn)狀、成果17-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)高劑量紫杉醇誘導的細胞侵襲的體外研究20-55
• 1.1 對象和方法20-27
• 1.1.1 細胞系20
• 1.1.2 實驗材料20-27
• 1.2 實驗方法27-41
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)27
• 1.2.2 原位雜交和免疫組化檢測miR-21和CDK5的表達水平27-29
• 1.2.3 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達水平29-32
• 1.2.4 Real-time PCR檢測不同濃度紫杉醇對miR-21表達水平的影響32-34
• 1.2.5 免疫熒光檢測侵襲偽足的形成34-35
• 1.2.6 Transwell和劃痕檢測細胞遷移和侵襲能力35-36
• 1.2.7 Western blot檢測CDK5通路中相關(guān)蛋白的表達水平36-37
• 1.2.8 Western blot檢測敲除和過表達CDK5后EMT相關(guān)蛋白的表達情況37-38
• 1.2.9 免疫熒光檢測EMT相關(guān)蛋白的表達情況及亞細胞定位38
• 1.2.10 Western blot檢測CDK5RAP1、Egr-1 和p39表達水平38
• 1.2.11 免疫共沉淀檢測CDK5和p39之間的相互作用38-39
• 1.2.12 免疫熒光檢測p39的亞細胞定位39
• 1.2.13 Western blot檢測細胞核和細胞質(zhì)中p39的表達水平39-40
• 1.2.14 統(tǒng)計學方法40-41
• 1.3 實驗結(jié)果41-51
• 1.3.1 miR-21和CDK5的表達水平與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系41-42
• 1.3.2 不同劑量紫杉醇對EMT相關(guān)蛋白表達水平的影響42-43
• 1.3.3 不同劑量紫杉醇對miR-21表達水平的影響43
• 1.3.4 AC1MMYR2對侵襲偽足形成的影響43-44
• 1.3.5 AC1MMYR2對細胞侵襲和遷移的影響44-45
• 1.3.6 AC1MMYR2對CDK5通路中相關(guān)蛋白表達的影響45-46
• 1.3.7 敲除和過表達CDK5對EMT相關(guān)蛋白表達的影響46-47
• 1.3.8 AC1MMYR2對EMT標志物蛋白表達的影響及亞細胞定位47-48
• 1.3.9 AC1MMYR2對CDK5RAP1、Egr-1 和p39表達的影響48-49
• 1.3.10 AC1MMYR2對CDK5和p39之間相互作用的影響49-50
• 1.3.11 AC1MMYR2對p39的亞細胞定位的影響50
• 1.3.12 AC1MMYR2對細胞核和細胞質(zhì)中p39表達水平的影響50-51
• 1.4 討論51-54
• 1.4.1 miR-21和CDK5的表達水平與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系51
• 1.4.2 高劑量紫杉醇對EMT的影響51-52
• 1.4.3 AC1MMYR2對高劑量紫杉醇誘導的細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響52
• 1.4.4 CDK5在AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)高劑量紫杉醇誘導的細胞侵襲中的地位52-53
• 1.4.5 AC1MMYR2調(diào)控CDK5活性的機制53-54
• 1.5 小結(jié)54-55
• 二、AC1MMYR2抑制腫瘤發(fā)生、減少高劑量紫杉醇誘導的腫瘤轉(zhuǎn)移體內(nèi)研究55-64
• 2.1 實驗材料55-56
• 2.1.1 細胞系及重組慢病毒載體55
• 2.1.2 實驗動物55
• 2.1.3 實驗藥品與試劑55
• 2.1.4 實驗儀器55-56
• 2.2 實驗方法56-57
• 2.2.1 重組慢病毒的轉(zhuǎn)染56
• 2.2.2 乳腺癌原位腫瘤模型56-57
• 2.2.3 H＆E染色57
• 2.2.4 免疫組化檢測CDK5和 β-catenin57
• 2.2.5 統(tǒng)計學處理57
• 2.3 結(jié)果57-62
• 2.3.1 腫瘤治療的效果57-59
• 2.3.2 肺轉(zhuǎn)移情況59-60
• 2.3.3 H＆E染色和免疫組化結(jié)果60-61
• 2.3.4 AC1MMYR2逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導的腫瘤轉(zhuǎn)移的機制61-62
• 2.4 討論62-63
• 2.5 小結(jié)63-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明71-72
• 綜述 MiRNAs在調(diào)控EMT過程中的作用72-87
• 綜述參考文獻79-87
• 致謝87

【共引文獻】

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本文編號：1105857