本文關(guān)鍵詞：BLU基因在胃癌中的表達(dá)及其甲基化調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景與目的腫瘤抑制基因BLU的表觀遺傳學(xué)沉默與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),然而,BLU在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在初步探討B(tài)LU基因在胃癌中的表達(dá)變化及其甲基化調(diào)控機(jī)制。方法(1)用實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)法檢測52例胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織、6株胃癌細(xì)胞(SGC7901,HGC27,BGC823,MKN45,MGC803,AGS)及胃黏膜正常上皮細(xì)胞GES-1中BLU m RNA表達(dá)水平,Western blot法檢測7株細(xì)胞中BLU蛋白表達(dá)水平;(2)采用Promoter Scan program軟件預(yù)測BLU核心啟動(dòng)子區(qū),并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,采用TFSEARCH和Methyl Primer Express#174;Software v1.0軟件預(yù)測BLU核心啟動(dòng)子區(qū)中可能有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的功能性Cp G位點(diǎn);(3)重亞硫酸鹽測序PCR(BSP)法分析胃癌細(xì)胞和組織中BLU核心啟動(dòng)子區(qū)Cp G位點(diǎn)的甲基化程度,初步分析DNA甲基化和BLU基因表達(dá)的關(guān)系,找出潛在的功能性Cp G位點(diǎn);(4)去甲基化藥物處理AGS和SGC7901細(xì)胞,q RT-PCR和Western blot法分析處理后BLU表達(dá)變化;(5)si RNA干擾Sp1表達(dá)及雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),分析BLU表達(dá)是否受轉(zhuǎn)錄因子Sp1調(diào)控;(6)在AGS和SGC7901細(xì)胞中,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)方法分析Sp1能否與BLU啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析SGC7901細(xì)胞中BLU-39Cp G位點(diǎn)甲基化對Sp1結(jié)合能力的影響;(7)通過CCK-8實(shí)驗(yàn)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn),研究BLU表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖能力及克隆形成能力的影響。結(jié)果(1)6株胃癌細(xì)胞中BLU表達(dá)水平均顯著低于胃黏膜正常上皮細(xì)胞株GES-1,69.2%(36/52)的胃癌組織中BLU m RNA表達(dá)明顯低于對應(yīng)癌旁組織,且胃癌組織臨床病理特征均與BLU表達(dá)之間無顯著相關(guān)性;(2)BLU基因核心啟動(dòng)子區(qū)位于-181~+63bp,軟件預(yù)測出-85Cp G和-39Cp G是潛在的功能性Cp G位點(diǎn);(3)胃癌細(xì)胞和組織中BLU表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(尤其是-39Cp G位點(diǎn)的甲基化)負(fù)相關(guān),提示-39Cp G是潛在的功能性Cp G位點(diǎn);(4)去甲基化藥物處理AGS和SGC7901細(xì)胞后,BLU表達(dá)出現(xiàn)不同程度的恢復(fù);(5)BLU轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄因子Sp1的激活;(6)Sp1結(jié)合于BLU近端啟動(dòng)子區(qū)(-43~35bp),且其結(jié)合位點(diǎn)“GC box”中-39Cp G位點(diǎn)的甲基化可降低其結(jié)合能力,進(jìn)而阻礙BLU基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá);(7)通過si RNA干擾BLU的表達(dá)之后,SGC7901細(xì)胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著提高。結(jié)論(1)BLU基因在胃癌中的失活與其核心啟動(dòng)子(尤其是-39Cp G位點(diǎn))高甲基化有關(guān);(2)轉(zhuǎn)錄因子Sp1可激活BLU的轉(zhuǎn)錄,-39Cp G位點(diǎn)甲基化可阻礙Sp1結(jié)合于BLU啟動(dòng)子區(qū),這可能是胃癌中BLU基因沉默的機(jī)制之一;(3)BLU可抑制胃癌細(xì)胞的生長,是胃癌潛在的抑癌基因,且去甲基化藥物處理可恢復(fù)其表達(dá)。BLU有望成為胃癌診斷和表觀遺傳學(xué)治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 BLU DNA甲基化 腫瘤抑制基因 Sp1
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料和方法11-37
• 結(jié)果37-48
• 討論48-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 綜述：抑癌基因BLU甲基化與腫瘤的關(guān)系57-67
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 中英文對照縮略詞表67-68
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-70

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本文編號：1101255