本文關鍵詞：乙酰肝素酶調(diào)控VEGF-C的表達及其對胰腺癌細胞體外侵襲凋亡的影響

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【摘要】：背景：胰腺癌是目前消化道腫瘤中惡性程度最高,診治最為困難的腫瘤。據(jù)報道,胰腺癌患者診斷后5年生存率為6.8%至25%,手術后病人的中位生存期為8至12個月。由于其生物學行為與解剖位置的特殊性,80%以上的患者發(fā)現(xiàn)時病情已屬晚期,失去接受根治性手術的機會,早期發(fā)現(xiàn)治療仍是提高患者預后的唯一途徑。同時,淋巴結轉移是影響患者術后長期生存的獨立危險因素,有淋巴結轉移者生存期多小于2年。因而,發(fā)現(xiàn)一種特異性強靈敏度高的腫瘤標志物是迫切需要的。乙酰肝素酶(HPSE)是一種糖類內(nèi)切酶,可特異性地切斷硫酸乙酰肝素(HS)支鏈。HS作為一種黏多糖,在細胞外基質(zhì)(ECM)及細胞表面具有恒定表達。HPSE的活性通過重塑上皮下及內(nèi)皮下基膜、促進腫瘤細胞的轉移及血管生成而實現(xiàn)。血管內(nèi)皮細胞生長因子C(VEGF-C)可與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的VEGFR-3特異性的結合,因而VEGF-C被認為是促進淋巴管形成的關鍵細胞因子。腫瘤細胞通過表達VEGF-C提高癌周淋巴管密度(LVD),促進腫瘤細胞經(jīng)淋巴途徑轉移。HPSE與VEGF-C均可作為細胞因子協(xié)同促進頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而兩者在胰腺癌細胞中的表達關系及對胰腺癌細胞惡性生物學行為的影響尚未闡明。目的：本實驗通過構建含人類HPSE基因的質(zhì)粒及針對HPSE基因的小干擾RNA(siRNA),觀察此基因過表達與干擾對BxPC-3細胞(胰腺癌細胞系)VEGF-C表達水平的影響。同時檢測轉染后細胞體外侵襲能力和凋亡的變化,闡明胰腺癌細胞中兩種基因的表達相關性及產(chǎn)生的生物學效應。方法：構建含HPSE基因的重組質(zhì)粒GV230/HPSE及針對HPSE基因的siRNA,脂質(zhì)體介導法轉染BxPC-3細胞,實時熒光定量PCR技術(RT-qPCR)檢測HPSE及VEGF-C的mRNA水平,蛋白免疫印跡技術(Western-blot)檢測兩種目的蛋白的水平,Transwell侵襲實驗及細胞劃痕實驗觀察轉染細胞體外侵襲遷移能力的改變,流式細胞術(FCM)評估轉染細胞的凋亡情況。結果：RT-qPCR結果顯示,GV230/HPSE組與空白對照組相比HPSE mRNA與VEGF-C mRNA分別出現(xiàn)了10.7倍與3.24倍的增高,干擾組則分別出現(xiàn)2.45倍與1.84倍的降低。Western-blot結果顯示,GV230/HPSE組HPSE及VEGF-C的蛋白水平均增高(P0.01),HPSE-siRNA組兩種蛋白水平均降低(P0.01)。Transwell侵襲實驗中,過表達組的侵襲細胞數(shù)138±5個,干擾組的侵襲細胞數(shù)53±4個,均較空白對照組(104±9個)有統(tǒng)計學意義的差別(P0.05)。流式細胞學結果顯示,干擾組早期凋亡細胞占3.63%,晚期凋亡細胞占5.02%,較陰性對照組有輕微提高。結論：HPSE可調(diào)控胰腺癌細胞VEGF-C的表達和體外侵襲能力,抑制其表達可誘導細胞凋亡。
【關鍵詞】：胰腺癌 乙酰肝素酶 血管內(nèi)皮生長因子C RNA干擾 腫瘤侵潤
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號說明10-11
• 前言11-13
• 1 材料與方法13-17
• 1.1 細胞培養(yǎng)與傳代13
• 1.2 設計并合成人HPSE基因過表達載體13-14
• 1.3 設計合成針對HPSE基因的siRNA14
• 1.4 脂質(zhì)體介導的重組質(zhì)粒、siRNA轉染宿主細胞14
• 1.5 Reverse transrciption-PCR及Real time-qPCR檢測HPSE及VEGF-C的mRNA水平14-15
• 1.6 Western blot檢測HPSE及VEGF-C蛋白的表達情況15-16
• 1.7 細胞劃痕實驗與Transwell侵襲實驗16
• 1.8 流式細胞術檢測HPSE抑制對細胞凋亡影響16
• 1.9 實驗數(shù)據(jù)的處理16-17
• 2 結果17-19
• 2.1 轉染效率17
• 2.2 重組質(zhì)粒及不同干擾片段對HPSE及VEGF-C的mRNA水平影響17
• 2.3 免疫印跡法檢測各實驗組HPSE與VEGF-C蛋白表達量的變化17-18
• 2.4 各實驗組細胞體外侵襲遷移能力的變化18
• 2.5 抑制HPSE對細胞凋亡的影響18-19
• 3 討論19-22
• 文獻綜述22-34
• 附錄34-39
• 參考文獻39-46
• 致謝46-47
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄47-48
• 學位論文評閱及答辯情況表48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李陽;劉浩;黃瑩瑩;浦龍健;張旭東;蔣志文;蔣琛琛;;順鉑聯(lián)合肝素酶抑制劑對鼻咽癌細胞增殖和侵襲遷移的影響[J];藥學學報;2013年04期

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本文編號：1100642