發(fā)布時間：2017-10-26 22:06

  本文關(guān)鍵詞：乙酰肝素酶調(diào)控VEGF-C的表達(dá)及其對胰腺癌細(xì)胞體外侵襲凋亡的影響

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【摘要】：背景：胰腺癌是目前消化道腫瘤中惡性程度最高,診治最為困難的腫瘤。據(jù)報(bào)道,胰腺癌患者診斷后5年生存率為6.8%至25%,手術(shù)后病人的中位生存期為8至12個月。由于其生物學(xué)行為與解剖位置的特殊性,80%以上的患者發(fā)現(xiàn)時病情已屬晚期,失去接受根治性手術(shù)的機(jī)會,早期發(fā)現(xiàn)治療仍是提高患者預(yù)后的唯一途徑。同時,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者術(shù)后長期生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者生存期多小于2年。因而,發(fā)現(xiàn)一種特異性強(qiáng)靈敏度高的腫瘤標(biāo)志物是迫切需要的。乙酰肝素酶(HPSE)是一種糖類內(nèi)切酶,可特異性地切斷硫酸乙酰肝素(HS)支鏈。HS作為一種黏多糖,在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及細(xì)胞表面具有恒定表達(dá)。HPSE的活性通過重塑上皮下及內(nèi)皮下基膜、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及血管生成而實(shí)現(xiàn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(VEGF-C)可與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3特異性的結(jié)合,因而VEGF-C被認(rèn)為是促進(jìn)淋巴管形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)VEGF-C提高癌周淋巴管密度(LVD),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴途徑轉(zhuǎn)移。HPSE與VEGF-C均可作為細(xì)胞因子協(xié)同促進(jìn)頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而兩者在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系及對胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未闡明。目的：本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建含人類HPSE基因的質(zhì)粒及針對HPSE基因的小干擾RNA(siRNA),觀察此基因過表達(dá)與干擾對BxPC-3細(xì)胞(胰腺癌細(xì)胞系)VEGF-C表達(dá)水平的影響。同時檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外侵襲能力和凋亡的變化,闡明胰腺癌細(xì)胞中兩種基因的表達(dá)相關(guān)性及產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。方法：構(gòu)建含HPSE基因的重組質(zhì)粒GV230/HPSE及針對HPSE基因的siRNA,脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)檢測HPSE及VEGF-C的mRNA水平,蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-blot)檢測兩種目的蛋白的水平,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外侵襲遷移能力的改變,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)評估轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果：RT-qPCR結(jié)果顯示,GV230/HPSE組與空白對照組相比HPSE mRNA與VEGF-C mRNA分別出現(xiàn)了10.7倍與3.24倍的增高,干擾組則分別出現(xiàn)2.45倍與1.84倍的降低。Western-blot結(jié)果顯示,GV230/HPSE組HPSE及VEGF-C的蛋白水平均增高(P0.01),HPSE-siRNA組兩種蛋白水平均降低(P0.01)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)組的侵襲細(xì)胞數(shù)138±5個,干擾組的侵襲細(xì)胞數(shù)53±4個,均較空白對照組(104±9個)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P0.05)。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示,干擾組早期凋亡細(xì)胞占3.63%,晚期凋亡細(xì)胞占5.02%,較陰性對照組有輕微提高。結(jié)論：HPSE可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)和體外侵襲能力,抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：胰腺癌 乙酰肝素酶 血管內(nèi)皮生長因子C RNA干擾 腫瘤侵潤
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號說明10-11
• 前言11-13
• 1 材料與方法13-17
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代13
• 1.2 設(shè)計(jì)并合成人HPSE基因過表達(dá)載體13-14
• 1.3 設(shè)計(jì)合成針對HPSE基因的siRNA14
• 1.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞14
• 1.5 Reverse transrciption-PCR及Real time-qPCR檢測HPSE及VEGF-C的mRNA水平14-15
• 1.6 Western blot檢測HPSE及VEGF-C蛋白的表達(dá)情況15-16
• 1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)16
• 1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測HPSE抑制對細(xì)胞凋亡影響16
• 1.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理16-17
• 2 結(jié)果17-19
• 2.1 轉(zhuǎn)染效率17
• 2.2 重組質(zhì)粒及不同干擾片段對HPSE及VEGF-C的mRNA水平影響17
• 2.3 免疫印跡法檢測各實(shí)驗(yàn)組HPSE與VEGF-C蛋白表達(dá)量的變化17-18
• 2.4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體外侵襲遷移能力的變化18
• 2.5 抑制HPSE對細(xì)胞凋亡的影響18-19
• 3 討論19-22
• 文獻(xiàn)綜述22-34
• 附錄34-39
• 參考文獻(xiàn)39-46
• 致謝46-47
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄47-48
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李陽;劉浩;黃瑩瑩;浦龍健;張旭東;蔣志文;蔣琛琛;;順鉑聯(lián)合肝素酶抑制劑對鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2013年04期

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本文編號：1100642