血小板衍生生長因子C在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究

發(fā)布時間：2017-10-26 07:41

本文關(guān)鍵詞：血小板衍生生長因子C在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究

【摘要】：血小板衍生因子C(PDGF-C)屬于血小板衍生因子(PDGF)家族的一員。在正常細(xì)胞中PDGF-C僅有少量表達(dá),而在癌癥組織中,PDGF-C表達(dá)增加,且與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PDGF-C可介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生多種生物學(xué)行為,一般通過結(jié)合其受體PDGFα或β發(fā)揮生物學(xué)功能,有研究表明PDGF-C可以促進(jìn)新生血管的形成,可促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和增殖。PDGF-C還是一類被大家所認(rèn)可的可以激活成纖維細(xì)胞的細(xì)胞因子。在乳腺癌中,腫瘤組織中表達(dá)有大量的PDGF-C,且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),而微環(huán)境中成纖維細(xì)胞上表達(dá)有PDGF-C的受體PDGFα和β,PDGF-C通過與其受體結(jié)合,激活受體,活化的受體導(dǎo)致酪氨酸激酶通路激活,介導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化,參與多種細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞微環(huán)境的形成。越來越多的研究者認(rèn)為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身,而且取決于其所生長的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成。在乳腺癌中,高轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者基質(zhì)組織中存在大量的活化的成纖維細(xì)胞,又稱癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞(CAFs)。作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,CAFs與乳腺癌的進(jìn)展息息相關(guān),CAFs可以分泌多種因子介導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展,促進(jìn)乳腺癌的浸潤、增殖和轉(zhuǎn)移。研究者們廣泛認(rèn)同的如SDF-1/CXCR4(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體4)生物軸,SDF-1/CXCR4是CAFs分泌的重要因子,CAFs通過分泌SDF-1/CXCR4促進(jìn)腫瘤的定向轉(zhuǎn)移和血管的生成。CAFs還可以通過分泌其他因子來促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,如肝細(xì)胞生長因子的(HGF),表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b FGF),胰島素樣生長因子(IGF)等。CAFs是正常的成纖維細(xì)胞經(jīng)過一些特定的細(xì)胞因子的刺激,使之成為活化的成纖維細(xì)胞(CAFs)。因此阻斷腫瘤微環(huán)境中CAFs的活化過程能阻斷腫瘤的發(fā)展過程。PDGF-C通過與其受體結(jié)合介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化,因此降低PDGF-C的表達(dá)也可阻止成纖維細(xì)胞的活化�；蛐蛄芯幋a的蛋白最終得以表達(dá)需通過轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程。由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的復(fù)雜性,使人類的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)也在多個層面異常復(fù)雜。其中基因表達(dá)調(diào)控非常重要的一個環(huán)節(jié)就是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)的最重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)之一就是m RNA的穩(wěn)定性。Hu R是研究的最為成熟的一種RNA結(jié)合蛋白,分布于與多種組織中,包括乳腺、脾臟等,Hu R通過于m RNA 3’UTR區(qū)的AU富集元件結(jié)合激活其功能,增強(qiáng)m RNA的穩(wěn)定性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)組前期的研究發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)有大量的Hu R,而低轉(zhuǎn)移性乳腺癌中Hu R的表達(dá)水平較低,文獻(xiàn)也有類似的報(bào)道。我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在PDGF-C m RNA的3’UTR區(qū)存在5個AU富集元件,可能是Hu R的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建PDGF-C m RNA的3’UTR區(qū)載體,轉(zhuǎn)染入Hu R高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中,雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)Hu R可明顯的增加熒光素酶基因的表達(dá),且在第2個和第4個結(jié)合位點(diǎn)基因表達(dá)增長較明顯,由此可知Hu R可作用于PDGF-C m RNA的3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)PDGFC。在MDA-MB-231細(xì)胞中,通過si RNA降低Hu R的表達(dá),用western blot技術(shù)檢測在Hu R不同表達(dá)水平下PDGF-C表達(dá)水平的變化,研究發(fā)現(xiàn)利用si RNA降低Hu R的表達(dá)后,PDGF-C的表達(dá)也降低。說明Hu R可以調(diào)節(jié)PDGF-C的表達(dá),且為正向調(diào)節(jié)。微小RNA(mi R)也是通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。mi R是一類小的非編碼RNA分子,貫穿癌癥的整個發(fā)生、發(fā)展過程,多與原癌基因或抑癌基因相關(guān)。mi R一般通過結(jié)合靶基因m RNA的3’UTR區(qū),降解靶基因的m RNA,從而降低靶基因編碼蛋白的表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)分析找出可能作用于PDGF-C m RNA的3’UTR區(qū)的mi R,通過與PDGF-C m RNA的3’UTR的熒光載體共同轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中,培養(yǎng)48小時后,雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證有生物學(xué)功能的mi R,研究發(fā)現(xiàn)在分析軟件分析出的17種mi R只有mi R-382-5p降低讀數(shù)最明顯;將mi R-382-5p類似物轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中,用western blot技術(shù)檢測PDGF-C的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染入mi R-382-5p類似物后PDGF-C的表達(dá)降低。這就證明mi R-382-5p可以作用于PDGF-C m RNA的3’UTR區(qū),降解PDGF-C的m RNA,使PDGF-C表達(dá)下調(diào)。同時我們利用RT-PCR技術(shù)檢測惡性程度不同的兩種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞中mi R-382-5p表達(dá)情況,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性高的MDA-MB-231細(xì)胞中mi R-382-5p表達(dá)低,而在轉(zhuǎn)移性低的MCF-7細(xì)胞中mi R-382-5p表達(dá)高,符合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的邏輯。Hu R和mi R-382-5p都可以作用于PDGF-C的3’UTR區(qū),且同時存在與乳腺癌腫瘤組織中。將乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞分為3組,第1組MDA-MB-231細(xì)胞正常培養(yǎng),第2組給細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-382-5p類似物,第3組轉(zhuǎn)染Hu R的si RNA,western blot實(shí)驗(yàn)檢測PDGF-C的表達(dá)差異。研究發(fā)現(xiàn)PDGF-C在第一組表達(dá)最高,第二組稍有降低,第三組顯著降低,說明Hu R和mi R-382-5p都可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)PDGF-C的表達(dá),且分別為正向和負(fù)向調(diào)節(jié)。在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中,PDGF-C可激活腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。本研究設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白Hu R可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR區(qū),上調(diào)PDGF-C的表達(dá),而mi R-382-5p可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR區(qū),但降低PDGF-C的表達(dá)。使我們對乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)機(jī)制的研究有了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：PDGF-C 乳腺癌 腫瘤微環(huán)境 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 miR HuR
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：