本文關鍵詞：雄激素受體對三陰性乳腺癌增殖調(diào)控作用的研究

  更多相關文章： 雄激素受體 三陰性乳腺癌 p53 p73 p21

【摘要】：研究背景：惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一,在中國,已經(jīng)成為疾病的死因之首,其發(fā)病率與死亡率每年都在升高。近些年,惡性腫瘤已經(jīng)成為中國重要的公共健康問題。研究表明,乳腺癌是全球女性發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤之一。最新發(fā)布的中國2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,女性常見的惡性腫瘤為：結直腸癌、支氣管肺癌、乳腺癌、胃癌及食管癌,占據(jù)所有女性惡性腫瘤發(fā)病例數(shù)的近60%,其中乳腺癌發(fā)生率為女性所有惡性腫瘤中的15%,其發(fā)病率占據(jù)首位。乳腺癌的發(fā)病人群主要集中于30-59歲的女性,是45歲以下女性常見的癌癥死亡原因。如今,越來越多的女性受到乳腺癌的威脅。因此,腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究及乳腺癌的治療已經(jīng)成為目前研究者關注的熱點。腫瘤的發(fā)生是一個復雜的、多基因驅動的過程。最新的研究表明,腫瘤的演化經(jīng)過3個不同的階段：突破階段、擴張階段與浸潤階段。每個階段都涉及多種基因的驅動,在合適的局部環(huán)境下,多種基因相互影響最終導致了腫瘤的發(fā)生。不同腫瘤的發(fā)生涉及不同的生長調(diào)控通路的激活。乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤,其中激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色,根據(jù)激素受體表達情況的不同可將乳腺癌分為4種不同的分子分型：Luminal A,Luminal B,人類表皮生長因子受體-2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)過表達與基底樣型。其中三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)與基底樣型乳腺癌大約有80%的重合,是一類特殊類型的乳腺癌。TNBC大約占侵襲性乳腺癌的10%-20%,具有惡性程度高、侵襲能力強、復發(fā)率高的特點,與其他類型的乳腺癌相比,其5年生存率及總生存率更低。由于缺乏常見激素受體的表達,如雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)與HER-2,針對ER、HER-2的內(nèi)分泌及分子靶向治療并不能在這一類人群中獲益。除此以外,TNBC惡性程度高,與其他類型乳腺癌相比腫瘤體積大、分期高、診斷初期發(fā)生淋巴結侵襲的幾率高。盡管TNBC缺乏ER、PR及HER-2表達,有研究表明TNBC中還存在其他受體表達,如胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor,IGFR)、雄激素受體(androgen receptor,AR)等。AR與ER同為核激素受體,其在超過三分之一的TNBC中有表達,在體內(nèi)、體外實驗中均有證明AR能促進乳腺癌細胞的增殖。運用藥物性AR阻斷劑比卡魯胺能有效抑制AR陽性TNBC細胞的增殖,使腫瘤生長減慢。為了進一步驗證AR抑制劑的安全性及有效性,有臨床研究表明,運用比卡魯胺在ER(-)/PR(-)/AR(+)轉移性乳腺癌中能獲得19%臨床獲益率。另有一項Ⅱ期臨床試驗評估新一代AR抑制劑恩雜魯胺在TNBC中安全性的研究也在進行中(NCT01889238).除此以外,有病例分析報道,一位55歲的AR陽性轉移性TNBC女性,接受每日150mg口服比卡魯胺治療,4個月后達到了臨床獲益。AR與ER同為核激素受體,是配體依賴性轉錄因子,可作用于下游靶基因啟動子結合位點調(diào)控下游基因的表達,影響細胞的功能。為了進一步研究AR在TNBC中的作用,我們在AR激動劑及拮抗劑處理后檢測了細胞中p53、p73、p21及Cyclin D1的表達。p53是經(jīng)典的抑癌基因,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。p53與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化密切相關。然而,p53在人類腫瘤中是突變率最高的抑癌基因。有研究表明,突變的p53特別是常見的突變位點的p53不僅會喪失野生型p53抑制腫瘤的作用,還會有誘導腫瘤發(fā)生的作用。在TNBC中,p53突變較為常見。而p73屬于p53超家族的成員,在腫瘤中的突變發(fā)生率較低,1997年由學者Kaghad等發(fā)現(xiàn)位于1p36上的基因。p73基因在腫瘤中能發(fā)揮抑制腫瘤增殖、誘導凋亡的作用。p53在腫瘤細胞中能活化下游多種信號通路,細胞周期依賴性激酶抑制因子p21是p53信號通路中的關鍵因子,能夠通過p53依賴或非依賴性途徑引起細胞周期阻滯,影響腫瘤細胞的分化。研究目的與意義：TNBC是乳腺癌中的一特殊類型,侵襲性及惡性程度較高,復發(fā)率及死亡率一直居高不下。ER、PR及HER-2在TNBC中表達為陰性。靶向ER及HER-2的乳腺癌內(nèi)分泌治療及分子靶向治療并不能在TNBC中獲益,因此缺乏有效治療方法的情況下,與其他類型乳腺癌相比TNBC總體生存率與無進展生存期更低。研究表明AR在TNBC中有一定量的表達,近些年AR成為乳腺癌中預后及治療預測因子,越來越多的研究者關注AR在乳腺癌特別是TNBC中的作用。本研究旨在探究靶向AR是否能影響TNBC細胞增殖及相關蛋白(p53、p73、p21及Cyclin D1)的表達,為了解AR在TNBC中的作用及為其用于臨床治療提供理論依據(jù)。研究方法：本研究運用AR激動劑雙氫睪酮(5-a-dihydrotestosterone,DHT)及拮抗劑比卡魯胺(bicalutamide)處理TNBC細胞株(MDA-MB-231及Hs578T),觀察AR對TNBC細胞增殖、凋亡的影響；并在細胞及小鼠水平檢測雙氫睪酮及比卡魯胺處理后對AR及相關蛋白(p53、p73、p21、Cyclin D1)水平表達的變化,揭示了AR對p73、p21蛋白表達調(diào)控的可能機制。為深入理解AR在調(diào)控TNBC增殖中的作用與AR抑制劑用于AR陽性的TNBC治療提供理論依據(jù)。本研究選擇兩株TNBC細胞株(MDA-MB-231,Hs578T)、Bab1/c小鼠作為研究對象進行研究。具體實驗方法如下：1.通過MTT(溴化噻唑藍四氮唑)比色法、細胞計數(shù)及流式細胞術檢測AR激動劑雙氫睪酮、拮抗劑比卡魯胺對TNBC細胞增殖與凋亡的影響。2.通過免疫印跡(Western Blotting)檢測雙氫睪酮、比卡魯胺處理后對腫瘤增殖相關蛋白p53、p73、p21及Cyclin Dl蛋白水平表達的影響。3.通過生物信息學在線預測軟件預測AR與p73、p21結合位點的結合,運用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)、瓊脂糖凝膠電泳PCR驗證AR與p73、p21的結合情況,對比雙氫睪酮處理后與對照組相比結合位點的差異,探討AR在雙氫睪酮作用后對p73及p21表達調(diào)控的可能機制。4.通過用Babl/c小鼠及TNBC細胞株MDA-MB-231建立皮下移植瘤模型,建瘤成功后給予雙氫睪酮、比卡魯胺處理,觀察用藥后不同處理組腫瘤大小變化及通過免疫組化檢測不同處理后腫瘤組織中AR、p73及p21的表達變化。實驗結果：1.MTT實驗證實,與對照組相比,AR激動劑雙氫睪酮處理后TNBC細胞株MDA-MB-231及Hs578T增殖加快,細胞早期凋亡率減�。欢卓箘┍瓤敯纷饔煤�,TNBC細胞MDA-MB-231及Hs578T增殖受到抑制,早期凋亡率增加。2.細胞計數(shù)實驗結果顯示：隨著時間的遞增,細胞數(shù)目增加,與對照組相比,TNBC細胞株MDA-MB-231在雙氫睪酮處理后細胞數(shù)目增加更快,抑制劑比卡魯胺用藥組細胞數(shù)目增加減慢。Hs578T細胞株實驗組也得到相似的結果。3.免疫印跡實驗結果顯示：雙氫睪酮能增加MDA-MB-231細胞株中AR、p53及Cyclin D1蛋白表達,減少p73、p21蛋白表達；比卡魯胺抑制AR、p53及Cyclin D1蛋白表達,對p73、p21的表達作用則相反。而在Hs578T中雙氫睪酮對p73表達調(diào)控作用并不明顯。4.通過生物信息學在線軟件預測到AR與p73、p21啟動子區(qū)均有結合位點,ChIP實驗發(fā)現(xiàn)AR能夠與p73、p21基因啟動子區(qū)結合,并且雙氫睪酮的處理對結合有影響作用。5.雙氫睪酮、比卡魯胺處理裸鼠移植瘤出現(xiàn)腫瘤體積差異,雙氫睪酮促進腫瘤生長,免疫組化結果顯示AR表達增加,p73及p21表達均有下調(diào),比卡魯胺能抑制移植瘤生長,AR表達下調(diào),p73及p21增加。結論：AR在MDA-MB-231及Hs578T兩株TNBC細胞株中均有表達,運用AR激動劑雙氫睪酮能促進AR蛋白水平在兩株細胞中升高,而AR拮抗劑比卡魯胺處理后AR表達水平有所下降。說明雙氫睪酮及比卡魯胺在兩株細胞中是有效的。進一步實驗證明,AR可通過雄激素雙氫睪酮被活化,上調(diào)突變p53、下調(diào)p73及p21的表達,從而促進AR陽性的TNBC細胞的增殖。AR抑制劑比卡魯胺可下調(diào)突變p53、促進p73、p21表達,誘導TNBC細胞株凋亡,抑制細胞增殖。ChIP實驗還發(fā)現(xiàn),AR能與p73、p21啟動子區(qū)結合,AR對p73、p21的調(diào)控主要通過結合其啟動子區(qū)實現(xiàn)。雙氫睪酮處理能促進AR與p73及p21啟動子區(qū)的結合。研究證明,AR對TNBC增殖有調(diào)控作用,抑制AR的活性能一定程度地抑制AR陽性乳腺癌細胞的增殖,我們認為靶向AR有可能使AR陽性的TNBC患者在臨床上獲益,延長生存時間。
【關鍵詞】：雄激素受體 三陰性乳腺癌 p53 p73 p21
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-21
• 第一章 實驗材料21-24
• 1.1 細胞株、Balb/c小鼠及實驗體系21
• 1.2 藥品與試劑21-22
• 1.3 材料與儀器22-24
• 第二章 實驗方法24-42
• 2.1 細胞培養(yǎng)方法及藥物配制24
• 2.2 MTT比色法檢測細胞增殖24-25
• 2.3 細胞計數(shù)法測定細胞增殖25-26
• 2.4 Annexin/PI染色檢測細胞凋亡26-27
• 2.5 蛋白質(zhì)提取與濃度測定27-28
• 2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)28-33
• 2.7 ChIP實驗33-37
• 2.8 裸鼠移植瘤模型37-38
• 2.9 組織取材、固定與包埋蠟塊38-39
• 2.10 蘇木精-伊紅染色(H&E染色)39-40
• 2.11 免疫組織化學(IHC)40-41
• 2.12 統(tǒng)計學分析41-42
• 第三章 實驗結果42-52
• 3.1 AR在TNBC細胞株中表達42
• 3.2 AR激動劑雙氫睪酮及拮抗劑比卡魯胺對TNBC細胞株功能作用的影響42-44
• 3.2.1 AR激動劑雙氫睪酮及拮抗劑比卡魯胺對TNBC細胞增殖的影響42-43
• 3.2.2 AR激動劑雙氫睪酮及拮抗劑比卡魯胺對TNBC細胞凋亡的影響43-44
• 3.3 AR對TNBC細胞株MDA-MB-231及Hs578T中相關蛋白表達水平的影響44-47
• 3.3.1 AR對MDA-MB-231、Hs578T細胞株中p53蛋白水平表達的影響44-46
• 3.3.2 AR對MDA-MB-231、Hs578T細胞株中p73、p21、Cyclin D1蛋白水平表達的影響46-47
• 3.4 AR與p73及p21啟動子區(qū)結合情況47-49
• 3.4.1 生物信息學分析AR與p73、p21啟動子區(qū)結合情況47
• 3.4.2 ChIP實驗檢測AR與p73及p21結合情況47-49
• 3.5 AR對TNBC裸鼠移植瘤的影響49-52
• 3.5.1 AR對TNBC裸鼠移植瘤生長的作用49-50
• 3.5.2 AR對TNBC裸鼠移植瘤組織中蛋白水平表達的影響50-52
• 第四章 討論52-57
• 第五章 全文總結57-59
• 參考文獻59-65
• 綜述65-76
• 參考文獻71-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文76-77
• 致謝77-78

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