本文關鍵詞：體細胞重編程過程中Pkm2表達特征和功能研究

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【摘要】：實驗目的:癌癥是世界嚴重的公共衛(wèi)生問題,據(jù)國際癌癥研究機構公布的數(shù)據(jù)顯示,每年全球約800萬人死于癌癥。在我國每6分鐘就有一人被確診為癌癥,每天有8550人成為癌癥患者。因此,深入認識癌癥并尋找診斷治療癌癥的靶標刻不容緩。生物體的生存離不開能量的供應,腫瘤細胞也不例外。惡性腫瘤在有氧環(huán)境下仍然保持異常旺盛的糖酵解(Warburg效應),這種代謝的轉變是為了滿足腫瘤增殖活力和生物合成的需求,其中一個起重要作用的關鍵酶便是丙酮酸激酶,其與多種腫瘤的分期分型、惡性程度等密切相關。但在腫瘤發(fā)生早期,Pkm2是如何發(fā)揮作用的,其復雜的表達調控是如何建立的尚不清楚。這是由于腫瘤發(fā)生的過程不能夠被人們捕捉的原因。隨著對腫瘤各方面性質的深入研究,人們發(fā)現(xiàn)腫瘤與干細胞存在密切聯(lián)系,如Wnt、Notch、SHH等信號通路的相似性,ES特異基因Oct4、Sox2、Nanog等在腫瘤中同樣高表達等。因此,我們擬把重編程過程作為模擬腫瘤發(fā)生的體外研究平臺,研究Pkm2在重編程過程中的表達模式及功能,探討其對重編程過程的影響和調控,為揭示Pkm2在腫瘤發(fā)生中的表達調控并發(fā)現(xiàn)新的潛在診療靶標提供理論基礎。實驗方法:首先,我們利用構建成功的二次重編程系統(tǒng)小鼠制備小鼠胚胎成纖維細胞(MEF細胞)。然后利用MEF細胞在含有強力霉素(Dox)的ES培養(yǎng)基中誘導重編程,成功得到誘導多功能干細胞(iPS cell)。隨后,利用shRNA將Pkm敲低后進行誘導,觀察克隆生成情況。為了檢測重編程過程中Pk基因的表達變化,我們在誘導過程中在不同的時間點取樣,用qPCR和Western Blot分別檢測Pkm1,pkm2的表達情況,對它們的表達變化進行分析。最后,通過qPCR檢測Pkm2的相關調控基因的表達。根據(jù)已知的Pkm2基因在腫瘤細胞中的調控情況,探尋在腫瘤細胞中相關調控基因Ptb,hnRANPA1,hnRNPA2B1,Hif-1α等在重編程過程中的表達趨勢。然后對它們進行上調或者敲低表達后,觀察其對重編程過程的影響及對Pkm2、Pkm1基因的調控作用。Pk基因的幾種亞型中,只有Pkm2能夠被變構調節(jié):低激酶活性的二聚體形式和高激酶活性的四聚體形式。在腫瘤細胞中高表達Pkm2二聚體形式,而高激酶活性的Pkm2四聚體形式表達較低。我們將利用Western Blot檢測在重編程過程中Pkm2兩種變構形式的變化關系。實驗結果:1、Pkm2在重編程過程中起到重要作用,不可或缺;2、Pkm2在多能細胞中入核或可作為轉錄因子參與基因調控;3、Pkm2在重編程過程中與其在腫瘤細胞已知的相關特征相一致,可以通過對重編程過程的研究構建其調控網絡,進一步探索新的可能的調控因子。
【關鍵詞】：誘導多能干細胞 重編程 丙酮酸激酶M2型
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 第1章 前言11-17
• 一、研究背景11-16
• 1、國內外腫瘤現(xiàn)狀11
• 2、腫瘤能量代謝特點11-12
• 3、PK在正常細胞和腫瘤細胞的表達模式12-13
• 4、腫瘤細胞中Pkm2與Pkm1的調節(jié)轉換13
• 5、Pkm2在腫瘤細胞中的功能13-14
• 6、Pkm2的高表達與腫瘤的關系及研究現(xiàn)狀14-15
• 7、利用重編程過程模擬腫瘤發(fā)生的過程15-16
• 二、研究思路16-17
• 1、技術路線16
• 2、研究內容16
• 3、總結16-17
• 第2章 材料和方法17-45
• 一、材料和儀器17-19
• 1、實驗動物17
• 2、實驗材料17-18
• 3、實驗儀器18-19
• 二、方法19-45
• 1、pFUW-Tet-On表達載體的構建19-27
• 2、p Sico-sh表達載體的構建27-30
• 3、i PS細胞系的建立和培養(yǎng)30-35
• 4、i PS細胞系的鑒定35-45
• 第3章 實驗結果45-53
• 一、可誘導型i PS細胞系的建立45-46
• 二、Pkm2在不同細胞中的表達情況46-47
• 三、Pkm在重編程過程中的表達47-48
• 四、敲低Pkm的表達對重編程過程的影響48-49
• 五、小結49
• 六、構建Pkm2相關載體進行深入研究49-50
• 七、Pkm2作為調控因子參與基因調控50-51
• 八、FUW-3F-Pkm2-P2A-MKO標簽表達載體的構建51-52
• 九、總結52-53
• 第4章 總結與討論53-56
• 第5章 參考文獻56-59
• 綜述 丙酮酸激酶M2型（PKM2）在腫瘤細胞中的功能及調控59-68
• 參考文獻65-68
• 致謝68-69

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1 谷瑞升;賈文文;田艷艷;杜生明;;重大研究計劃“細胞編程和重編程的表觀遺傳機制”中期進展概述[J];中國基礎科學;2013年05期

2 唐新杰;謝峰;張群;;細胞抽提物重編程作用的研究進展[J];組織工程與重建外科雜志;2011年01期

3 汪進益;范慧敏;劉中民;;內源性一氧化氮合酶抑制劑與重編程功能性心肌干細胞[J];組織工程與重建外科雜志;2011年01期

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5 劉雪霞;李建遠;;哺乳動物體細胞核移植后核重編程研究進展[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2008年06期

6 景秋洋;陳費;金圣博;何志穎;胡以平;;細胞直接重編程:從一種終末分化細胞直接重編程為另一種終末分化細胞[J];生命的化學;2012年04期

7 ;卵細胞對精子重編程機制被揭示[J];山東中醫(yī)藥大學學報;2011年06期

8 林真;沈曉麗;;轉導特定基因重編程體細胞為多能干細胞[J];基礎醫(yī)學與臨床;2010年02期

9 彭正軍;劉路;凌均h，

本文編號：1091125