本文關(guān)鍵詞：Embigin在乳腺癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制的研究

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【摘要】：背景及目的隨著發(fā)病率及死亡率的持續(xù)上升,癌癥已經(jīng)成為中國(guó)人群死亡的首要原因和主要的健康問(wèn)題。乳腺癌是女性中發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤,全球每年有180萬(wàn)乳腺癌新發(fā)病例,死亡人數(shù)達(dá)到了40多萬(wàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì),在2015年全國(guó)新增癌癥患者429萬(wàn),其中有27萬(wàn)為乳腺癌患者。在最近幾年中,乳腺癌的發(fā)病率正在以每年2.2%的增長(zhǎng)率增長(zhǎng),嚴(yán)重的威脅著女性的健康。免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)為一類具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖、分化以及細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的粘附作用的細(xì)胞粘附分子。Embigin為一種跨膜糖蛋白,是免疫球蛋白超家族中的一員,參與了鼠的胚胎發(fā)育及器官的發(fā)育過(guò)程。Embigin由一個(gè)含有兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū),一個(gè)含有29個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)以及一個(gè)含有47個(gè)氨基酸的胞內(nèi)區(qū)組成。近期有研究發(fā)現(xiàn),embigin在一些癌細(xì)胞中異常表達(dá),并可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。HOXC8屬于Hombox(HOX)蛋白家族的一員,具有轉(zhuǎn)錄因子的作用,參與了包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和腫瘤生成等過(guò)程的調(diào)控。在宮頸癌、前列腺癌以及乳腺癌中,HOXC8的表達(dá)水平均高于其在正常組織中的水平,并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn),HOXC8具有促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用。同時(shí),也有報(bào)道指出,在鼠的胚胎成纖維細(xì)胞中HOXC8可以調(diào)控embigin的表達(dá),但其具體機(jī)制尚不明確。因此,本文旨在研究HOXC8對(duì)embigin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。內(nèi)容及方法1.HOXC8對(duì)EMB表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的研究(1)構(gòu)建HOXC8過(guò)表達(dá)及敲低的乳腺癌細(xì)胞系,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印記(western blot)等實(shí)驗(yàn),檢測(cè)HOXC8過(guò)表達(dá)和敲低的細(xì)胞中embigin的mRNA和蛋白的水平。(2)構(gòu)建Embigin啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體,將其轉(zhuǎn)入HOXC8過(guò)表達(dá)及敲低的乳腺癌細(xì)胞中,運(yùn)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(Luciferase reporter assay)研究HOXC8是否是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控embigin的表達(dá)。(3)在HOXC8過(guò)表達(dá)和敲低的細(xì)胞中進(jìn)行放線菌素實(shí)驗(yàn),研究HOXC8是否是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控embigin的表達(dá)。(4)分析Embigin啟動(dòng)子上可能的HOXC8結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP)確定HOXC8在embigin啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。2.研究EMB在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用將embigin過(guò)表達(dá)載體和embigin shRNA載體轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞中,構(gòu)建embigin過(guò)表達(dá)和敲低的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行：(1)MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)EMB對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力的影響；(2)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)(Soft agar assay),檢測(cè)embigin對(duì)乳腺癌細(xì)胞的非錨定依賴性生長(zhǎng)能力的影響；(3)小室遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell migration assay),檢測(cè)embigin對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響。3.研究HOXC8調(diào)控乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制在已構(gòu)建的HOXC8敲低細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染embigin shRNA載體,建HOXC8和embigin雙敲低乳腺癌細(xì)胞系,并在這些細(xì)胞中進(jìn)行：(1)MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)HOXC8對(duì)embigin在乳腺癌增殖中的影響；(2)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)(Soft agar colony formation assay),檢測(cè)HOXC8對(duì)embigin在乳腺癌非錨定依賴性生長(zhǎng)中的影響；(3)小室遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell migration assay),檢測(cè)HOXC8對(duì)embigin在乳腺癌細(xì)胞遷移中的作用的調(diào)控。結(jié)果1.HOXC8對(duì)embigin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的研究(1)過(guò)表達(dá)HOXC8降低了乳腺癌細(xì)胞中embigin的mRNA和蛋白水平,而敲低HOXC8增加了乳腺癌細(xì)胞中embigin的mRNA和蛋白水平。(2)過(guò)表達(dá)HOXC8的乳腺癌細(xì)胞中embigin啟動(dòng)子的熒光素酶活性降低了,而敲低HOXC8的乳腺癌細(xì)胞中embigin啟動(dòng)子的熒光素酶活性增加了。(3)放線菌素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)或敲低HOXC8對(duì)EMB的mRNA的穩(wěn)定性沒(méi)有影響。(4)用HOXC8抗體沉淀下來(lái)的DNA進(jìn)行PCR,只有位于embigin啟動(dòng)子起始位點(diǎn)上游-2315到-2303的引物擴(kuò)增出了條帶,其余引物均沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,表明HOXC8結(jié)合在embigin啟動(dòng)子的-2315到-2303堿基的區(qū)域。2.研究embigin在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用(1)過(guò)表達(dá)embigin后乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱,而敲低embigin增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的增殖能力；(2)過(guò)表達(dá)embigin后乳腺癌細(xì)胞形成的集落數(shù)明顯減少,而敲低embigin明顯增加了乳腺癌細(xì)胞形成的集落數(shù)；(3)過(guò)表達(dá)embigin的乳腺癌細(xì)胞遷移到Transwell小室下面的細(xì)胞數(shù)明顯減少,而敲低embigin明顯增加了遷移到Transwell小室下面的細(xì)胞數(shù)。3.研究HOXC8調(diào)控乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制(1)在乳腺癌細(xì)胞中敲低HOXC8,明顯降低了細(xì)胞的增殖能力,而敲低embigin可以恢復(fù)HOXC8對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力的影響；(2)在乳腺癌細(xì)胞中敲低HOXC8,減少了細(xì)胞形成的集落數(shù),而敲低embigin可以恢復(fù)HOXC8對(duì)乳腺癌細(xì)胞集落生成能力的影響；(3)在乳腺癌細(xì)胞中敲低HOXC8,明顯降低了遷移到Transwell小室下面的細(xì)胞數(shù),而敲低embigin可以恢復(fù)HOXC8對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)論1.在乳腺癌細(xì)胞中,HOXC8結(jié)合到embigin的啟動(dòng)子上,并抑制了embigin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。2.Embigin的表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、非錨定依賴性生長(zhǎng)以及遷移能力。3.HOXC8通過(guò)調(diào)控embigin的表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：Embigin HOXC8 乳腺癌
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 英文縮略詞表13-15
• 第一章 前言15-22
• 1.1 乳腺癌15
• 1.2 Embigin15-16
• 1.2.1 Embigin的結(jié)構(gòu)16
• 1.2.2 Embigin的功能16
• 1.3 HOX基因16-19
• 1.3.1 HOX基因的結(jié)構(gòu)17
• 1.3.2 HOX基因與機(jī)體的發(fā)育17-18
• 1.3.3 HOX基因與腫瘤18-19
• 1.4 HOXC819-20
• 1.4.1 HOXC8基因的結(jié)構(gòu)及功能19-20
• 1.4.2 HOXC8與腫瘤20
• 1.5 研究目的與內(nèi)容20-22
• 第二章 材料與方法22-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-28
• 2.1.1 細(xì)胞22
• 2.1.2 菌株及質(zhì)粒22-23
• 2.1.3 引物及shRNA序列23-24
• 2.1.4 試劑與耗材24-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟28-45
• 2.2.1 DNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)28-34
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)34-35
• 2.2.3 制備慢病毒35-36
• 2.2.4 慢病毒感染細(xì)胞36
• 2.2.5 蛋白質(zhì)印記36-39
• 2.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.2.7 染色質(zhì)免疫共沉淀40-42
• 2.2.8 MTT實(shí)驗(yàn)42
• 2.2.9 放線菌素實(shí)驗(yàn)42-43
• 2.2.10 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)43
• 2.2.11 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)43-45
• 第三章 HOXC8在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控EMB表達(dá)的機(jī)制45-58
• 3.1 在乳腺癌中HOXC8調(diào)控EMB的表達(dá)45-50
• 3.2 HOXC8在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控EMB的表達(dá)50-54
• 3.3 HOXC8在EMB啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的確定54-57
• 3.4 小結(jié)57-58
• 第四章 EMB在乳腺癌中的作用的研究58-68
• 4.1 構(gòu)建EMB過(guò)表達(dá)和敲低細(xì)胞株58-62
• 4.2 EMB對(duì)乳腺癌增值能力的影響62-63
• 4.3 EM B對(duì)乳腺癌非錨定依賴性生長(zhǎng)的能力的影響63-65
• 4.4 EMB對(duì)乳腺癌遷移能力的影響65-67
• 4.5 小結(jié)67-68
• 第五章 HOXC8調(diào)控EMB在乳腺癌中的作用68-74
• 5.1 構(gòu)建HOXC8和EMB雙敲低乳腺癌細(xì)胞68-69
• 5.2 HOXC8調(diào)控EMB對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用69-70
• 5.3 HOXC8調(diào)控EMB對(duì)乳腺癌細(xì)胞非錨定依賴性生長(zhǎng)的抑制作用70-71
• 5.4 HOXC8調(diào)控EMB對(duì)乳腺癌細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的抑制作用71-72
• 5.5 小結(jié)72-74
• 第六章 結(jié)果與討論74-77
• 參考文獻(xiàn)77-84
• 致謝84-85
• 發(fā)表論文85

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