本文關鍵詞：維生素D對惡性轉(zhuǎn)化的小鼠卵巢表面上皮細胞腫瘤干細胞樣細胞特性的影響

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【摘要】：目的:課題組前期研究發(fā)現(xiàn),干細胞標志物CD44、CD117、CD133以及胚胎干細胞標志物Oct4等在早期小鼠卵巢表面上皮(Mouse Ovarian Surface Epithelial,MOSE)細胞存在表達,并且陽性率隨著MOSE細胞體外傳代次數(shù)的增加而增加,細胞自我更新能力增強,表明腫瘤干細胞樣細胞特性的獲得參與了MOSE細胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)維生素D可以通過抑制EMT過程延緩MOSE細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程。2013年《Nature Medicine》報道,在卵巢門部位的表面上皮細胞中存在干細胞生龕(niche),參與卵巢表面上皮細胞的損傷修復,并且可能是上皮型卵巢癌的起源。我們知道90%的卵巢癌屬于上皮型卵巢癌,而且大多數(shù)卵巢癌患者被診斷時已處于晚期。由于其對抗腫瘤藥物不敏感等特性而易復發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前關于上皮型卵巢癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的假說認為,在卵巢癌中存在的一種異質(zhì)性強且具有干細胞特性的小群體細胞,稱之為腫瘤干細胞(cancer stem-like cells,CSCs)。這種腫瘤干細胞可能來源于Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)紊亂的成體干細胞。另外,耐藥基因ABCG2在干細胞群體中過表達,可以泵出外來物如Hoechst 33342。因此,本研究使用流式細胞術,從晚期已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的MOSE細胞(MOSE cells in late,M-L)中分選側(cè)群(Side Population,SP)細胞,與非側(cè)群細胞(non-side population,NSP)相比較,研究SP細胞是否具有腫瘤干細胞樣特性,并且觀察活性維生素D對SP細胞干細胞特性的影響及其可能機制。為后續(xù)深入探索卵巢癌腫瘤干細胞的特性及尋找消滅腫瘤干細胞的方法提供可靠的實驗研究資料。方法:本研究分為三個部分。(1)分離和鑒定卵巢癌干細胞樣細胞:利用分選流式細胞儀,從M-L細胞中分選SP細胞。使用無血清的干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng),以富集并擴增SP細胞。使用懸浮球成球率、限制性稀釋實驗檢測細胞自我更新能力,分析SP細胞干細胞標志物和多能干性相關基因的表達情況,比較SP細胞和NSP細胞在X射線和重粒子照射后存活曲線的差異,并且通過裸鼠體內(nèi)成瘤實驗判定SP細胞的致瘤性,評價SP細胞是否具有腫瘤干細胞的相關特性。(2)維生素D對SP細胞的作用:與未處理的sp細胞相比較,觀察活性維生素d(1?,25dehydroxyvitamind,1α,25(oh)2d3)處理組sp細胞懸浮球成球率、abcg2基因表達、干細胞標志物、多潛能干性相關基因表達以及細胞周期等變化,檢測1α,25(oh)2d3是否可以提高sp細胞對化療藥物紫杉醇的敏感性,通過體外matrigel實驗和體內(nèi)裸鼠致瘤性實驗,綜合分析1α,25(oh)2d3對sp細胞干細胞特性的影響。(3)1α,25(oh)2d3在卵巢癌干細胞樣細胞中潛在的作用靶點:與對照組sp細胞相比較,檢測1α,25(oh)2d3處理后sp細胞中β-catenin、c-myc、cyclind1和dkk-1等基因和蛋白表達的變化;并分析維生素d受體(vitamindreceptor,vdr)、活性維生素d降解酶cyp24a1以及活化酶cyp27b1等基因的表達變化,初步探討活性維生素d對卵巢癌干細胞中潛在的作用靶點,為探索其發(fā)生機制提供研究基礎結(jié)果:(1)分離和鑒定卵巢癌干細胞樣細胞:使用分選流式細胞儀從已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的小鼠卵巢表面上皮細胞(m-l)中分選sp細胞,經(jīng)過體外無血清的干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng),sp細胞懸浮成球生長,懸浮球規(guī)則圓整,生長緩慢,逐步傳代培養(yǎng)過程中,棄去貼壁生長的細胞,提高sp細胞的純度。而nsp細胞初步培養(yǎng)時有少量懸浮球,但懸浮球不規(guī)則,最后均貼壁生長;懸浮球成球率的實驗結(jié)果顯示,各代sp細胞的懸浮球成球率均高于nsp細胞(p0.05);限制性稀釋實驗表明,形成一個腫瘤球只需要5.54個sp細胞,說明sp細胞的自我更新能力高;sp細胞的干細胞標志物(cd44和cd133)以及多能干性相關基因(sox2、klf4、notch1和notch2)的表達均高于nsp細胞;real-timeq-pcr結(jié)果顯示,sp細胞耐藥基因abcg2的表達量約為nsp細胞的3倍(p0.05),提示sp細胞可能表現(xiàn)為較強的耐藥性;x射線照射及重粒子輻照實驗結(jié)果顯示,在相同劑量照射下,當使用懸浮球形成率檢測存活曲線時,sp細胞的存活率明顯高于m-l和nsp細胞,說明sp細胞對x射線和100let的重粒子均具有較強的輻射抗性;皮下移植瘤的實驗顯示,sp細胞具有明顯地致瘤性,而nsp細胞在整個觀察期內(nèi)均未見裸鼠形成腫瘤。卵巢原位移植瘤的實驗顯示,sp細胞和nsp細胞原位接種都有致瘤性。病理切片結(jié)果顯示,sp組皮下腫瘤組織中可見血管形成和多核細胞,原位腫瘤組織中細胞形態(tài)各異,異質(zhì)性強。以上實驗結(jié)果表明,sp細胞具有腫瘤干細胞的相關特征,可以作為本研究分選腫瘤干細胞樣細胞的一種可行方法。(2)維生素d對sp細胞腫瘤干細胞特性的影響:分選的sp細胞在體外懸浮培養(yǎng)過程中加入10nm的1?,25(oh)2d3連續(xù)處理4代,發(fā)現(xiàn)sp細胞的懸浮球成球率降低、懸浮球的直徑明顯變小。說明維生素d可能抑制卵巢癌干細胞的自我更新能力;細胞周期分析結(jié)果顯示,1?,25(oh)2d3并沒有增加sp細胞中g0/g1期比例,處理前后sp細胞g0/g1期比例分別為57.95%、58.93%。說明,活性維生素d抑制卵巢癌干細胞的懸浮球成球率,可能與g0/g1期阻滯無關。細胞凋亡的實驗結(jié)果顯示,與紫杉醇單獨作用組相比較,1?,25(oh)2d3和紫杉醇聯(lián)合干預組sp細胞的凋亡并沒有增加說明,1?,25(oh)2d3不能增強紫杉醇對卵巢癌干細胞的促凋亡作用。real-timeq-pcr的實驗結(jié)果表明,1?,25(oh)2d3處理sp細胞后,abcg2的表達無明顯變化(p0.05),這也可能與1?,25(oh)2d3微弱的促凋亡作用有關。而real-timeq-pcr結(jié)果顯示,干細胞標志物cd133mrna的表達升高(p0.05),但多能干性相關基因sox2的表達明顯下降(p0.05),1?,25(oh)2d3對sp細胞干性的影響可能與sox2有關。將sp細胞接種于matrigel中,模擬體內(nèi)致瘤性,實驗結(jié)果顯示,1?,25(oh)2d3雖然促進了sp細胞50μm以下懸浮球成球率,但是抑制50μm以上懸浮球的成球率,對100μm以上的懸浮球并無影響。說明活性維生素d可以抑制sp細胞的錨著獨立生長能力。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果顯示,皮下注射sp細胞的裸鼠中,接種103和104個sp細胞組的成瘤數(shù)均為1,腫瘤潛伏期為30d,惡病質(zhì)發(fā)生于接種后58d,腫瘤組織中可見血管形成。維生素d3處理的皮下注射sp細胞裸鼠中,103和104個sp細胞接種量的成瘤數(shù)雖然也均為1個,但是,腫瘤潛伏期延長為45d,惡病質(zhì)發(fā)生于接種后68d,而腫瘤組織中血管形成減少,異質(zhì)性降低。皮下致瘤實驗結(jié)果表明,維生素d延緩了卵巢癌干細胞的成瘤時間及惡病質(zhì)進程。溶劑注射對照組的裸鼠,在原位注射sp細胞后第36d時,疑似惡病質(zhì)體征,在卵巢部位發(fā)現(xiàn)白色結(jié)節(jié),重量(包括卵巢)約為0.0563g,腹腔內(nèi)無腹水;而維生素d3注射組的裸鼠,在手術后第36d時,體重減輕,無法進食,疑似惡病質(zhì)體征,但解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)無腹水和腫瘤的形成。檢測各組血清25(oh)d的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1000iu/w的維生素d3注射劑處理后裸鼠血清中的25(oh)d,相對于各非維生素d3注射組高,且具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。說明,維生素d干預可以提高裸鼠血清25(oh)d水平,這可能是與其延緩卵巢癌干細胞所致的成瘤時間及惡病質(zhì)有關。(3)1α,25(OH)2D3對SP細胞VDR/β-catenin通路中相關分子表達的影響:Real-time Q-PCR結(jié)果中顯示,與對照組SP細胞相比較,1?,25(OH)2D3處理SP細胞3代后,β-catenin、DKK-1和CyclinD1等表達沒有明顯變化,而c-Myc的表達卻升高。Western Blot實驗結(jié)果顯示,1?,25(OH)2D3處理并沒有影響SP細胞β-catenin和CyclinD1的表達。維生素D代謝相關分子的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),1?,25(OH)2D3處理后的SP細胞VDR mRNA的表達較低,但是活性維生素D降解酶CYP24A1在1?,25(OH)2D3誘導下mRNA的表達量升高達70萬倍(P0.05),說明急劇增高的CYP24A1可能降解1?,25(OH)2D3,使其有效劑量減少;另外,低表達的VDR也可能導致SP細胞對1?,25(OH)2D3的反應遲鈍。結(jié)論:1.本實驗分選的SP細胞具有卵巢癌干細胞相關特性,可以作為腫瘤干細胞樣細胞的可靠模型;2.活性維生素D影響SP細胞的自我更新能力可能與下調(diào)Sox2表達有關;維生素D3干預可以延長裸鼠體內(nèi)SP細胞致瘤的潛伏期,以及帶瘤生存時間;3.SP細胞VDR低水平表達,以及活性維生素D處理后其降解酶CYP24A1劇增可能是活性維生素D對SP細胞VDR/?-cantenin信號通路作用微弱的關鍵原因。
【關鍵詞】：惡性轉(zhuǎn)化的小鼠卵巢表面上皮細胞 腫瘤干細胞樣細胞 側(cè)群細胞 1α 25(OH)2D3 VDR β-catenin
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-18
• 第一部分 卵巢癌干細胞樣細胞的分選和鑒定18-42
• 1 材料與方法19-27
• 1.1 設備和器材19-20
• 1.2 試劑20-21
• 1.3 實驗方法21-27
• 1.4 統(tǒng)計學方法27
• 2 結(jié)果27-37
• 2.1 SP細胞的分選27-28
• 2.2 SP細胞的自我更新能力28-29
• 2.3 SP細胞的干細胞標志物表達29-30
• 2.4 SP細胞多能干性相關基因的表達30-31
• 2.5 SP細胞耐藥基因ABCG2的表達31-32
• 2.6 SP細胞對X射線和重粒子的輻射抗性32-34
• 2.7 SP細胞的體內(nèi)致瘤性34-37
• 3 討論37-42
• 第二部分 維生素D對SP細胞腫瘤干細胞特性的影響42-60
• 1 材料與方法42-45
• 1.1 設備和器材42-43
• 1.2 試劑43
• 1.3 方法43-45
• 2 結(jié)果45-55
• 2.1 1a,25(OH)_2D_3作用劑量的確定45
• 2.2 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞形態(tài)的影響45-46
• 2.3 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞懸浮球成球能力的影響46-47
• 2.4 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞干細胞標志物及多能干性相關基因的影響47-48
• 2.5 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞周期的影響48-49
• 2.6 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞抗藥性的影響49-50
• 2.7 Matrigel模擬體內(nèi)致瘤性實驗50-51
• 2.8 維生素D3對SP細胞致瘤性的影響51-55
• 3 討論55-60
• 第三部分 1α,25(OH)_2D_3對SP細胞VDR/β-catenin通路相關分子表達的影響60-72
• 1 材料與方法60-63
• 1.1 設備和器材60-61
• 1.2 試劑與試劑配方61
• 1.3 方法61-62
• 1.4 統(tǒng)計學方法62-63
• 2 結(jié)果63-68
• 2.1 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞VDR/β-catenin信號通路的影響63-66
• 2.2 1a,25(OH)_2D_3對SP細胞維生素D代謝降解酶和VDR基因的影響66-68
• 3 討論68-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻73-86
• 綜述：腫瘤中的Wnt信號通路86-104
• 綜述參考文獻96-104
• 研究生期間科研經(jīng)歷及發(fā)表文章104-105
• 附錄一：自發(fā)熒光細胞的比例測定105-106
• 附錄二：1a,25(OH)_2D_3對E-cadherin蛋白表達的影響106-107
• 中英縮略語對照表107-108
• 致謝108-111

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本文編號：1090193