本文關(guān)鍵詞：CD47通過穩(wěn)定SLC3A2調(diào)控肝癌細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)

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【摘要】：【研究背景及目的】肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,肝癌患者的總體生存時(shí)間較短,目前手術(shù)切除是肝癌患者最佳治療手段,但該方法僅適用于部分患者(約10%-20%),且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高,因此迫切需要尋找新的肝癌治療靶點(diǎn)與治療手段。肝癌的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥過程密切相關(guān),常伴有 肝炎-肝硬化-肝癌‖的慢性惡性轉(zhuǎn)化的過程。慢性炎癥與腫瘤的關(guān)系已得到了廣泛認(rèn)同,然而其機(jī)制仍需深入研究。CD47(Cluster of Differentiation 47)是一種普遍表達(dá)在人類細(xì)胞表面的糖蛋白分子,屬于免疫球蛋白超家族成員。早期發(fā)現(xiàn)CD47能與整合素αvβ3共沉淀而被稱之為整合素相關(guān)蛋白。人類多種腫瘤中CD47分子的表達(dá)水平均呈現(xiàn)上調(diào),在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞CD47通過抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫,逃避機(jī)體 免疫監(jiān)視‖,而這種作用是通過與巨噬細(xì)胞SIRPα(signal-regulatory protein alpha)相互作用實(shí)現(xiàn)的。在多種腫瘤的研究中,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)利用CD47單克隆抗體能有效抑制腫瘤的體內(nèi)生長,而對正常細(xì)胞影響較小。以上結(jié)果表明CD47分子可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為CD47單抗的治療效果與阻斷CD47介導(dǎo)的吞噬抑制作用有關(guān)。關(guān)于CD47在肝癌進(jìn)展中的作用研究尚處于初步階段。有文獻(xiàn)報(bào)道CD47參與調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞的存活與功能,但其所涉及的機(jī)制不為人知。細(xì)胞可以通過氧化還原酶類和其他抗氧化分子來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)(Redox Status)的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)超過細(xì)胞自身調(diào)節(jié)能力時(shí),會使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。因?yàn)橛性鰪?qiáng)的抗氧化系統(tǒng)保護(hù)腫瘤干細(xì)胞免遭ROS介導(dǎo)的損傷,所以在腫瘤干細(xì)胞當(dāng)中ROS水平往往較低,從而使其獲得抵抗化療和放療的能力。在這些抗氧化系統(tǒng)中,還原型谷胱甘肽是其中一種重要的細(xì)胞代謝產(chǎn)物,它的合成需要xc-系統(tǒng)的參與。xc-系統(tǒng)是胱氨酸-谷氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,由一條輕鏈(SLC7A11,solute carrier family 7 member 11)和一條重鏈(SLC3A2,solute carrier family 3 member 2)組成。其中SLC3A2分子可以與整合素相互作用從而介導(dǎo)整合素相關(guān)信號通路的激活,引起正常細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生。這讓我們想到SLC3A2可能與CD47分子有某些聯(lián)系。在本研究中,我們首先對肝癌標(biāo)本上CD47分子的表達(dá)進(jìn)行分析,然后對調(diào)控CD47分子表達(dá)的相關(guān)因素進(jìn)行研究,之后利用多種方法探究CD47分子對肝癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)CD47分子可以調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài),并對其可能的分子機(jī)制進(jìn)行探索,以期發(fā)現(xiàn)CD47分子對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的原因�！緦�(shí)驗(yàn)方法】1.應(yīng)用real-timepcr方法和冰凍切片細(xì)胞免疫熒光的方法檢測肝癌組織標(biāo)本中cd47分子表達(dá)的情況;并利用大鼠den誘導(dǎo)肝癌模型檢測在 肝炎-肝硬化-肝癌‖病程進(jìn)展中cd47分子表達(dá)水平的變化。2.利用流式細(xì)胞儀、real-timepcr和共聚焦顯微鏡檢測nf-κb信號通路的活化對cd47分子表達(dá)水平的影響,并通過軟件分析cd47啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),并通過染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)(chip)加以驗(yàn)證。3.建立cd47分子干擾和過表達(dá)肝癌細(xì)胞系,應(yīng)用cck-8方法檢測cd47分子干擾和過表達(dá)組與對照組細(xì)胞的增殖能力;應(yīng)用westernblot方法檢測cd47分子表達(dá)水平的高低對細(xì)胞egf信號通路的影響。4.應(yīng)用裸鼠荷瘤模型檢測cd47分子高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。5.通過transwell小室法檢測cd47分子表達(dá)水平的高低對細(xì)胞體外遷移能力的影響。6.應(yīng)用real-timepcr方法檢測cd47分子高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,并用試劑盒檢測葡萄糖消耗和乳酸生成的變化。7.用ros特異的熒光探針dcfh-da檢測cd47分子高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響。8.應(yīng)用real-timepcr方法檢測cd47分子高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響,并檢測細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的含量。9.應(yīng)用質(zhì)譜分析方法檢測與cd47相互作用的分子并通過免疫共沉淀方法進(jìn)行驗(yàn)證�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.肝癌標(biāo)本中cd47表達(dá)水平相比于癌旁和遠(yuǎn)端有明顯的升高,且在den大鼠誘導(dǎo)肝癌模型中表達(dá)水平隨著病程的進(jìn)展不斷升高。2.nf-κb信號通路的活化可以上調(diào)cd47分子的表達(dá),p65蛋白通過與cd47啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控cd47分子表達(dá)。3.cd47分子促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)體外增殖能力,遷移能力并且cd47分子促進(jìn)肝癌細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因的表達(dá),增加肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸的產(chǎn)生。4.cd47分子的表達(dá)可以降低細(xì)胞內(nèi)ros水平,參與細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)控。5.cd47分子促進(jìn)肝癌細(xì)胞抗氧化基因的表達(dá),并且升高肝癌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量,提高還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比值。6.質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)cd47分子可以和slc3a2分子相互作用,通過免疫共沉淀方法也得到了驗(yàn)證。【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】本研究證實(shí)了肝癌標(biāo)本中cd47分子表達(dá)水平較高,并在肝癌模型中證明cd47表達(dá)水平隨著病程的進(jìn)展不斷升高。炎性因子TNFα等激活NF-κB信號通路可能是導(dǎo)致其升高的因素。CD47通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平來促進(jìn)肝癌的惡性表型,并且其對氧化還原狀態(tài)的調(diào)控可能是通過與SLC3A2分子相互作用來完成的。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞癌 人CD47蛋白 活性氧
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-14
• 試劑和儀器14-19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-33
• 討論33-36
• 參考文獻(xiàn)36-42
• 綜述42-57
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明57-58
• 致謝58-59

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