本文關鍵詞：FAM172A基因功能及其轉錄調(diào)節(jié)機制的初步研究

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【摘要】：結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大約有140萬新發(fā)病例,同時至少70萬患者死亡。在我國,大腸癌在惡性腫瘤中已排第4～6位,盡管目前結直腸癌相關手術、放化療方案的治療方法,已經(jīng)提高了早期患者的生存率,但大多數(shù)伴有轉移的結直腸癌患者不適合傳統(tǒng)的治療方式,五年生存率10%。發(fā)病年齡趨向年輕化,嚴重影響國人健康水平。目前臨床常用的抗腫瘤化學治療藥物均有不同程度的毒副作用,它們在殺傷腫瘤細胞的同時,也殺傷正常組織的細胞。同時,腫瘤細胞的抗藥性在很大程度上加重了人類對新型抗腫瘤藥物需求的緊迫性。而由于基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細胞的異型性,從基因或其他方面研究具體腫瘤,是一項異常艱巨的任務。因此,研制新的抗腫瘤藥物、改變藥物的抗腫瘤作用方式,這是擺在科研工作者面前的重要研究課題�？拱┑鞍�(anticancer protein)是隨著腫瘤研究的不斷進展,基于免疫和分子生物學的發(fā)展被新近提出的一種治療策略,已成為腫瘤治療研究的一個新的熱點�？鼓[瘤蛋白特點為分子質(zhì)量小,極易穿透瘤細胞,具有較強的穩(wěn)定性,可以通過提高免疫應答、抑制腫瘤血管形成、直接誘導腫瘤細胞凋亡或阻滯腫瘤細胞周期等作用方式抑制腫瘤的生長和轉移。通過前期實驗研究我們發(fā)現(xiàn)了一個人類功能未知的新基因,其對結腸癌細胞系LoVo細胞存在有絲分裂抑制作用,故將其命名為AC-01。經(jīng)過生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)AC-01,即為FAM172A (family with sequence similarity 172, member A),定位于染色體5q15,其表達范圍廣泛,包括單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、人胚胎腎細胞、尿道上皮、肝細胞、大腸上皮細胞及多種腫瘤細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn),FAM172A能夠顯著抑制人大腸癌細胞系LoVo細胞的增殖,那么,FAM172A有可能通過抑制人大腸癌細胞LoVo細胞的有絲分裂從而達到抑制其增值的作用。根據(jù)近年來有關抗癌蛋白的研究,我們推測FAM172A可能是一種抗癌蛋白,該基因是一個典型的抑癌基因,這就提示FAM172A蛋白將可能成為一種新的抗癌蛋白用于大腸癌的生物治療。因此,本課題計劃在前期實驗基礎上,進一步明確FAM172A抑制大腸癌生長的核心作用,擬探討FAM172A基因表達調(diào)控機制,主要明確其轉錄前水平的調(diào)節(jié)機制,即研究該基因的核心啟動子以及調(diào)控其表達的關鍵轉錄因子,為FAM172A應用于大腸癌的生物治療提供實驗證據(jù)。目的：進一步明確FAM172A對大腸癌細胞的抑制作用,并探討其轉錄調(diào)節(jié)機制。方法：1、生物學信息學分析利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線查找FAM172A的mKNA序列,用mRNA序列在人類基因組序列作BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),尋找最匹配的基因組序列,確定基因轉錄起始位點,其中轉錄起始位點處的第一個核苷酸定位為+1。使用UCSC Genome Browse (http://genome.ucsc.edu/)和Ensemble Genome Browse (http://asia.ensembl.org/index.html)預測FAM172A基因的啟動子序列。2、全基因組DNA提取與質(zhì)粒構建根據(jù)NCBI檢索出的FAM172AmRNA序列及預測的啟動子序列,使用軟件Vector NTI Advance 11.5.1設計其特異性引物,擴增其DNA(其中,擴增FAM172A啟動子序列時,使用Genomic DNA Purification kit (Promega)試劑盒提取人全血中全基因組DNA,以此為模板),并分別連接至pcDNA3.1(-)和pGL4.10載體,構建FAM172A蛋白基因及其啟動子的重組質(zhì)粒。3、明確FAM172A蛋白抑制大腸癌細胞增殖及促進凋亡分化的作用(1)從大腸癌細胞系LoVo細胞內(nèi)提取總RNA,逆轉錄成cDNA后,成功擴增FAM172A序列,連接至pET32a(+),成功構建pET32a(+)-FAM172A重組載體,將構建好的pET32a(+)-FAM172A轉化至大腸桿BL21(DE3), IPTG大量誘導表達并制備、純化多克隆抗體；培養(yǎng)大腸癌細胞系LoVo細胞及SW480細胞,將提取的FAM172A重組蛋白按照不同的濃度(0、0.1、1.0、10和100ng/ml)與大腸癌細胞共培養(yǎng),分別培養(yǎng)12、24、36、48h后,收集大腸癌細胞后,使用流式細胞術檢測細胞周期及細胞數(shù)量；使用XTT實驗檢測大腸癌細胞的增殖情況；(2)將構建好的FAM172A重組質(zhì)粒及FAM172A干擾質(zhì)粒分別轉染至大腸癌細胞中,培養(yǎng)48小時后,收集細胞,使用AnnexinV-7AAD試劑及流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；4、 FAM172A蛋白基因啟動子的克隆與初步分析提取提取人全血全基因組DNA,根據(jù)生物信息學預鋇FAM172A蛋白基因的啟動子序列,設計其特異性引物,擴增其DNA,并連接至pGL4.10載體,構建FAM172A蛋白基因啟動子的重組質(zhì)粒,將構建好的FAM172A基因啟動子的重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5α,擴增培養(yǎng),并中提重組質(zhì)粒,瞬時轉染FAM172A重組質(zhì)粒和pGL4.10空載至大腸癌細胞系LoVo細胞,利用Luciferase報告基因技術檢測重組質(zhì)粒的活性。5, FAM172A蛋白基因核心啟動子的鑒定與分析通過不斷截短上述構建啟動子序列,設計各自特異性引物,擴增其DNA,并連接至pGL4.10載體,構建FAM172A蛋白基因各截短啟動子的重組質(zhì)粒,將構建好的FAM172A基因各截短啟動子的重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5α,擴增培養(yǎng),并中提重組質(zhì)粒,瞬時轉染FAM172A各截短重組質(zhì)粒和pGL4.10空載至大腸癌細胞系LoVo細胞,利用Luciferase報告基因技術分別檢測各截短重組質(zhì)粒的活性,比較其活性,鑒定出核心啟動子序列。6、關鍵轉錄因子對FAM172A蛋白的轉錄活性的作用研究根據(jù)生物信息學預測與FAM172A蛋白基因的核心啟動子序列結合的轉錄因子,預測其序列,提取大腸癌細胞系LoVo細胞總RNA,逆轉錄為cDNA,設計轉錄因子的特異性引物,擴增其cDNA,并連接至pcDNA3.1(-)載體,構建轉錄因子的表達質(zhì)粒。瞬時共轉染核心啟動子重組質(zhì)粒和轉錄因子的表達質(zhì)粒,通過設置分組,利用Luciferase報告基因技術,檢測轉錄因子活性,再通過EMSA(電泳遷移率實驗)、ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)等實驗技術鑒定出能與核心啟動子序列特異性結合的關鍵轉錄因子。瞬時轉染關鍵轉錄因子表達載體和轉錄因子的siRNA至大腸癌細胞系LoVo細胞,通過Real-time PCR和Western blotting觀察FAM172A基因的轉錄水平以及蛋白的表達水平,從而說明轉錄因子對FAM172A蛋白轉錄水平的影響。7、統(tǒng)計學分析本實驗采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)分析,文章中所有的計量資料的實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤來表示。計量資料的組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗,多組的組間比較采用方差分析。P0.05為有統(tǒng)計學差異。本文所有實驗均獨立進行3次,取其平均值進行統(tǒng)計學分析。結果：1、為了驗證FAM172A能否影響到大腸癌細胞的細胞周期,我們將提取的FAM172A重組蛋白按照不同的蛋白濃度,與大腸癌細胞SW480共培養(yǎng),分別于12、24、36、48h收集細胞,使用流式細胞儀檢測大腸癌細胞的細胞周期情況。我們發(fā)現(xiàn)處于S期的大腸癌SW480細胞及所有大腸癌細胞的數(shù)量均有所減少,并且隨著FAM172A重組蛋白的濃度的增加,S期的大腸癌SW480細胞及所有大腸癌細胞的數(shù)量減少的就越多,呈劑量依賴性。另外,在FAM172A重組蛋白的最高濃度為0.1 μg/ml時,處于S期的大腸癌SW480細胞減少至3.18%。這些結果說明FAM172A能夠明顯抑制大腸癌細胞的增殖,尤其在FAM172A重組蛋白濃度高于0.1 μg/ml時。在XTT增殖實驗中,我們發(fā)現(xiàn),與對照組相比,FAM172A能夠明顯抑制大腸癌細胞的增長(p0.01),且抑制FAM172A表達后,大腸癌細胞增長增多(p0.05),且增長速度增加。這些結果表明FAM172A能夠明顯抑制大腸癌細胞的增殖。2、我們使用流式細胞儀技術檢測FAM172A對大腸癌細胞系SW480細胞凋亡的影響,結果發(fā)現(xiàn),過表達FAM172A能夠使得大腸癌SW480細胞凋亡的數(shù)量增加(p0.01),而抑制FAM172A表達后,大腸癌SW480細胞凋亡的數(shù)量明顯減少(p0.01),這些結果說明FAM172A能夠促進大腸癌細胞的凋亡。另外,我們還發(fā)現(xiàn),與FAM172A重組蛋白共培養(yǎng)后,分別在100倍和400倍顯微鏡下觀察,相對于對照組來說,發(fā)現(xiàn)FAM172A能夠誘導細胞分化。3、為了鑒定出FAM172A的啟動子序列,我們搜索NCBI數(shù)據(jù)庫和檢索UCSC genome Browser (http://genome.ucsc.edu/)，獲得FAM172A基因的mRNA序列,分析預測FAM172A基因的轉錄起始位點,通過BLAST,我們預測出FAM172A的啟動子序列為-740bp至+205bp,成功擴增出FAM172A的啟動子片段,將此預測的FAM172A的啟動子片段連接至pGL4.10載體,限制性內(nèi)切酶的分別為Xhol和EcoR V,我們將構建出的pGL4.10-FAM172A啟動子重組質(zhì)粒命名為P1,用于后續(xù)實驗及各截短啟動子的模板。將其轉染至大腸癌LoVo細胞中,培養(yǎng)24小時后,我們采用Luciferase報告基因技術檢測JFAM172A啟動子的活性,結果使用Firefly/Renilla比表示。我們發(fā)現(xiàn),與對照組pGL4.10 Basic空載相比,P1具有40倍的啟動子活性,這提示我們預測的啟動子片段在大腸癌LoVo細胞中具有啟動子活性。隨后我們不斷截短P1片段,分別構建5個截短的啟動子片段的重組質(zhì)粒,分別命名為P2、P3、P4、P5和P6,Luciferase報告基因技術檢測各截短啟動子的活性。結果發(fā)現(xiàn),在大腸癌細胞中,P6的啟動子活性最高。通過不斷的截短預測的啟動子序列,我們發(fā)現(xiàn)截短啟動子片段P6,-112 bp至+48bp,具有核心啟動子所必需的序列及結合位點,且具有較高的啟動子活性。4、接著,通過在線軟件TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCh. html) and GeneCards (http://www.genecards.org/)預測可能與FAM172A核心啟動子結合的轉錄因子,我們發(fā)現(xiàn),STAT1,一個得分最高的主要常見的轉錄因子,結合位點位于FAM172A核心啟動子區(qū)域內(nèi)。STAT1結合位點是-68bp和-58bp之間。5、為了驗證STAT1能否與FAM172A啟動子結合,我們做了染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)及凝膠電泳遷移滯后實驗(EMSA)。在ChIP實驗中,我們成功擴增了FAM172A核心啟動子序列,然后我們發(fā)現(xiàn)與IgG對照組相比,STAT1的結合位點位于FAM172A核心啟動子序列中。這個實驗說明STAT1能夠特異性結合于FAM172A啟動子序列。而在EMSA實驗中,我們設計了一個能和STAT1結合位點序列相同的寡聚核苷酸,稱為探針,用于這個實驗,我們發(fā)現(xiàn)從大腸癌LoVo細胞中的核提取物,能夠特異結合于帶標簽的探針,這些探針都具有STAT1結合位點序列,然后我們使用未標記的探針進行了競爭性實驗,發(fā)現(xiàn)標記的探針超出未標記的100倍,這也說明STAT1能夠結合于FAM172A啟動子序列,綜上所述,我們從體內(nèi)和體外分別證明了STAT1能夠特異性結合于FAM172A啟動子序列。6、為了明確轉錄因子STAT1能否促進FAM172A基因的表達,我們進行了western blot和實時熒光定量PCR。我們將STAT1基因過表達及干擾質(zhì)粒轉染至大腸癌LoVo細胞中,發(fā)現(xiàn)過表達STAT1后FAM172A蛋白及mRNA水平均明顯提高,干擾STAT1表達后,FAM172A蛋白及mRNA水平則出現(xiàn)下調(diào)。這些說明轉錄因子STAT1能夠促進FAM172A的表達。結論：1、FAM172A能夠抑制大腸癌細胞的增殖,并能夠促進大腸癌細胞的凋亡；2、我們成功克隆并鑒定出FAM172A的啟動子區(qū)域(-745bp至+205bp),具有明顯的啟動子活性,確定了FAM172A核心啟動子區(qū)域位于-112bp/+48bp；3、轉錄因子STAT1能夠特異性結合于FAM172A核心啟動子區(qū)域,增強其啟動子活性；4、轉錄因子STAT1能夠促進FAM172A蛋白的表達；5、這些發(fā)現(xiàn)對全面認識FAM172A基因的基本功能及了解其轉錄調(diào)控機制有重大意義。
【關鍵詞】：FAM172A 啟動子 轉錄調(diào)控 STAT1
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 第一章 明確FAM172A基因?qū)Υ竽c癌細胞的抑制作用21-35
• 1.1 實驗材料21-22
• 1.2 實驗方法與步驟22-31
• 1.3 實驗結果31-34
• 1.4 討論34-35
• 第二章 FAM172A基因啟動子的初步鑒定及其活性檢測35-48
• 2.1 實驗材料35-36
• 2.2 實驗方法與步驟36-42
• 2.3 實驗結果42-46
• 2.4 討論46-48
• 第三章 FAM172A核心啟動子區(qū)域的鑒定及其初步分析48-61
• 3.1 實驗材料48
• 3.2 實驗方法與步驟48-54
• 3.3 實驗結果54-58
• 3.4 討論58-61
• 第四章 轉錄因子STAT1對FAM172A基因的調(diào)控61-70
• 4.1 實驗材料61
• 4.2 實驗方法與步驟61-67
• 4.3 實驗結果67-69
• 4.4 討論69-70
• 第五章 全文小結70-71
• 參考文獻71-75
• 英文縮略詞75-77
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文77-78
• 致謝78-79

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