本文關(guān)鍵詞：高通量測序技術(shù)在骨髓增殖性腫瘤臨床檢測中的方法學(xué)建立及其初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 骨髓增殖性腫瘤 基因突變 Ion Torrent PGM 測序

【摘要】：研究背景與目的：骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)是一組起源于造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病,以外周血一系或多系細胞增多,易發(fā)生血栓和出血等并發(fā)癥,自發(fā)性向急性白血病和骨髓纖維化轉(zhuǎn)化為共同臨床特點的一類髓系增殖性疾病。1960年在慢性髓細胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)中發(fā)現(xiàn)Ph染色體；然而在隨后的半個多世紀(jì)里,對于Ph陰性的MPN遺傳學(xué)背景知之甚少。2005年獲得性點突變JAK2V617F的發(fā)現(xiàn),使MPN的研究迅速進入基因組時代。在隨后的10年,MPL (TPO受體)突變、JAK2第12外顯子的突變及編碼鈣網(wǎng)蛋白(CALR)的基因第9號外顯子突變相繼發(fā)現(xiàn)并被報道。JAK2V617F、MPL、JAK2第12外顯子以及CALR基因突變的發(fā)現(xiàn),使更多MPN患者找到了有力的診斷依據(jù)。目前,越來越多文獻報道兩種或多種基因突變同時存在的MPN病例,不同表型的MPN可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化甚至進展為急性髓系白血病,單一的分子突變已無法解釋此類MPN患者臨床表現(xiàn)型的多樣化。檢測多個分子以及綜合考慮各種分子學(xué)突變,才能更進一步了解MPN的發(fā)病機制、準(zhǔn)確評估患者的預(yù)后以及實現(xiàn)對MPN患者的個體化治療�？焖�、準(zhǔn)確和全面地獲取MPN患者的DNA分子遺傳信息對于臨床研究以及指導(dǎo)臨床治療具有十分重要的意義。對于每個生物體來說,其基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實地反映患者基因組DNA上的遺傳信息,進而比較全面地揭示患者基因組DNA的復(fù)雜性和多樣性。1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法,標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生。Sanger測序迄今為止仍是DNA測序的主流方法,但是測序速度慢、成本高、通量小使得傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要。新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的高通量測序技術(shù)。新一代測序技術(shù)具有速度快、準(zhǔn)確度高、成本低、覆蓋度深和產(chǎn)出巨大等優(yōu)點,研究者可以在短時間內(nèi)對感興趣的基因進行精確定位和分析,在臨床檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。Ion TorrentPGM測序儀是一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代測序技術(shù),通過專有的大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器,對于DNA復(fù)制時產(chǎn)生的離子流,實現(xiàn)直接和實時的檢測。IonTorrent技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、速度快、靈活性大等優(yōu)點。目前已應(yīng)用于多領(lǐng)域的研究,如癌癥、遺傳疾病、婦嬰健康領(lǐng)域、血液相關(guān)疾病、微生物研究和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等。Thermo Life公司推出的AmpliSeq建庫方案,該技術(shù)僅利用20ng樣品就可在一管中同時擴增6144種PCR片段,使科研人員能快速的分析成千上萬個目標(biāo)基因。目前Thermo Life已推出了商業(yè)化Cancer Hotspot Panel,其中大多基因涉及的是實體腫瘤,其對血液系統(tǒng)疾病的研究還較少。Ion Torrent PGM測序平臺的可擴展性允許研究人員可以自由的選擇感興趣的幾十甚至幾百個基因定制多重PCR引物試劑盒。通過查閱大量文獻,我們定制了MPN致病相關(guān)基因的多重PCR引物試劑盒,包括JAK2、MPL、CALR、KIT、ASXL1、IDH1、 IDH2、LNK、CBL、TET2、EZH2、DNMT3A、U2AF1、SRSF2、SF3B1、CSF3R、 TP53、SOCS1、SOCS2、SOCS3、NRAS、KRAS及NEF共23種基因。本課題第一部分的目的是在于研究Ion Torrent PGM測序平臺及定制的MPN多重引物試劑盒在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學(xué)建立。結(jié)合近年來的研究,約95%-98%的PV (Polycythemia vera)、約50%-60%的ET (Essential thrombocythemia)及PMF (Primary myelofibrosis)患者存在JAK2突變,約4%的ET患者及8%的PMF患者存在MPL突變,CALR突變在PV患者中罕見,在ET患者中的突變率約為15%-24%,在PMF患者中的突變率約為25%-35%左右。然而,仍有15%的MPN病人不存在以上三種突變,此類MPN歸類于三陰性MPN。目前對于三陰性的MPN,因為缺乏三種主要的分子學(xué)突變,造成其診斷困難。本課題第二部分的目的在于研究三陰性MPN患者的分子學(xué)異常,通過新一代測序技術(shù)獲得三陰性MPN疾病相關(guān)基因序列信息,為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)。研究對象：1、收集2015年1月至2015年10月就診于南方醫(yī)院并診斷為Ph陰性的MPN患者骨髓標(biāo)本10例,10例患者均已行Sanger測序法檢測JAK2和CALR基因。4例JAK2V617F陽性患者,4例CALR基因突變陽性患者(2例CALR基因52bp缺失,2例CALR基因5bp插入),2例JAK2V617F和CALR基因突變同時存在的患者(1例CALR基因52bp缺失,1例CALR基因3bp缺失)。2、收集2015年1月至2015年10月就診于南方醫(yī)院并確診為Ph陰性的MPN患者骨髓標(biāo)本10例,10例患者均已經(jīng)Sanger測序法檢測JAK2和CALR基因陰性,ET病人骨髓標(biāo)本6例,CNL病人骨髓標(biāo)本1例,PMF病人骨髓標(biāo)本3例。研究方法：1、篩選目的基因、定制MPN多重PCR引物試劑盒利用Ion AmpliSeq Designer引物設(shè)計工具,對通過查閱大量文獻獲得的23個目標(biāo)基因進行多重PCR引物設(shè)計,定制MPN多重PCR引物試劑盒。2、DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書操作,提取骨髓細胞DNA。3、Sanger測序用經(jīng)典的Sanger測序方法檢測MPN患者的MPL基因突變情況。4、Ion Torrent PGM測序1)文庫構(gòu)建檢測DNA濃度,加無酶水稀釋到10ng/ul。按照試劑盒說明書操作,擴增目的基因DNA、消化引物、加barcode接頭、純化擴增文庫,最后定量文庫。2)模板制備分別在Ion OneTouch Two和Ion OneTouch ES儀器上進行乳液PCR和陽性模板富集。3) Ion Torrent PGM測序?qū)⒅苽涞哪０寮又罥on 316芯片上,在PGM測序儀上測序,測序原始數(shù)據(jù)儲存在Ion Torrent PGM服務(wù)器上,用ionreporter (ionreporter.thermofisher.com)軟件對結(jié)果進一步分析。結(jié)果：1、Ion Ampliseq Designer設(shè)計MPN多重PCR引物用Ion Ampliseq Designer對23個MPN致病相關(guān)基因設(shè)計多重PCR引物,結(jié)果如下：該MPN panel大小為52.42kb,共有283個擴增子,可以覆蓋97.28%的目標(biāo)區(qū)域,PCR擴增在兩管內(nèi)完成,分別有145和138個擴增子,擴增子的長度在125bp和275bp之間。2、Sanger檢測MPL突變情況對第一部分和第二部分共20例MPN患者的MPL基因進行Sanger測序,20例MPN患者MPL基因突變均為陰性。3、Ion Torrent PGM測序質(zhì)控以一張316芯片為例,芯片中磁珠覆蓋率為66%,產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)236Mb。磁珠文庫連接率為100%,其中33%磁珠連接多克隆文庫,67%磁珠連接單克隆文庫。所有單克隆文庫中,除去1%測試片段,12%接頭二聚體,10%低質(zhì)量文庫,最終有效單克隆文庫為77%,有效讀取片段共2,159,538個。片段平均讀長為181bp,中位讀長為196bp。不同位置的堿基平均讀取準(zhǔn)確度為99.3%。其中達到AQ20(與參考序列99%匹配)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)為207 Mb。Ion Torrent PGM測序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：磁珠覆蓋率60%,磁珠文庫連接率80%,連接多克隆文庫磁珠40%,測試片段5%。整張芯片測序質(zhì)控達到Ion Torrent PGM測序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以樣品P1為例,單個樣品測序質(zhì)控結(jié)果顯示：讀取71,322,697個堿基,能達到AQ20標(biāo)準(zhǔn)的堿基數(shù)為64,123,648,平均測序深度為1,302×。4、Ion Torrent PGM測序結(jié)果分析1)對10例已經(jīng)用Sanger測序法檢測JAK2、MPL和CALR三個基因的MPN患者進行Ion Torrent PGM測序,就JAK2、MPL、CALR三個基因而言,3例CALR基因52bp缺失均未被Ion Torrent PGM測序檢出,其余測序結(jié)果與Sanger測序結(jié)果完全吻合。Ion Torrent PGM測序結(jié)果可以顯示基因位置、突變類型、氨基酸的改變和測序深度,最重要的是Ion Torrent PGM測序能顯示突變所占的比例,從而對腫瘤細胞負荷進行定量。2)10例三陰性MPN患者Ion Torrent PGM測序結(jié)果顯示：1例ET患者未檢測出基因突變,其余9例患者均檢測到突變,突變個數(shù)為1.3個。其中最常見的為表觀遺傳修飾基因TET2突變,4例患者檢測出TET2基因突變。1例慢性中性粒細胞白血病病人檢測出CSF3RT618I突變。1例PMF患者檢測出TP53基因突變。除此之外,突變還涉及剪接體基因、信號傳導(dǎo)相關(guān)基因等。結(jié)論：1、本研究結(jié)合自己定制的MPN多重PCR引物試劑盒和Ion Torrent PGM測序平臺,成功的建立了一套靈敏特異、快速、高通量的MPN致病相關(guān)基因突變檢測方法。Ion Torrent PGM測序能對腫瘤細胞負荷進行定量,為臨床醫(yī)生評估患者治療療效提供了依據(jù)。2、Ion Torrent PGM測序平臺對長片段的缺失檢出存在缺陷,需要進一步優(yōu)化平臺。3、幾乎所有的三陰性MPN患者都存在基因突變,其中表觀遺傳修飾基因TET2突變最常見。此外突變還涉及剪接體基因、信號傳導(dǎo)相關(guān)基因等。
【關(guān)鍵詞】：骨髓增殖性腫瘤 基因突變 Ion Torrent PGM 測序
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 高通量測序平臺在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學(xué)建立16-48
• 前言16-21
• 1 材料和方法21-33
• 2 結(jié)果33-44
• 3 討論44-48
• 第二章 高通量測序技術(shù)檢測三陰性骨髓增殖性腫瘤基因突變48-64
• 前言48
• 1 材料和方法48-49
• 2 結(jié)果49-53
• 3 討論53-64
• 參考文獻64-79
• 全文小結(jié)79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果80-81
• 致謝81-82

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 傅俊英;趙蘊華;;DNA測序技術(shù)領(lǐng)域的相關(guān)政府投入分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2012年05期

2 ;低成本的DNA測序技術(shù)將引領(lǐng)醫(yī)療保健的變革[J];科技創(chuàng)業(yè);2010年06期

3 ;第三代測序技術(shù)簡介[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2011年02期

4 余馨;劉啟剛;王明蓉;;高通量DNA測序技術(shù)在抗體新藥研發(fā)中的應(yīng)用[J];藥學(xué)學(xué)報;2012年03期

5 韋貴將;鄒秉杰;陳之遙;宋沁馨;李佑志;周國華;;新一代測序技術(shù)的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2012年19期

6 劉英華;陳瑛;;高通量測序技術(shù)的最新研究進展[J];中國婦幼保健;2013年12期

7 蔡曉靜;朱煌;孔繁琪;馮婕妤;趙立全;牛宗鎮(zhèn);;DNA測序技術(shù)的進展和挑戰(zhàn)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2013年20期

8 劉莉揚;張學(xué)工;;高通量測序技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年16期

9 劉燕;;新一代測序準(zhǔn)備好了嗎[J];IT經(jīng)理世界;2013年17期

10 趙曉娟,劉金毅,蔡有余,琦祖和;發(fā)展中的DNA測序技術(shù)[J];生物工程進展;1997年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何彪;涂長春;;下一代測序技術(shù)的應(yīng)用及展望[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

2 李曉峰;劉公社;;利用454測序技術(shù)大規(guī)模挖掘羊草抗逆轉(zhuǎn)錄因子的研究[A];中國草學(xué)會牧草育種委員會第七屆代表大會論文集[C];2009年

3 張卉;秦利濤;吳東;王紅丹;廖世秀;;新一代測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[A];第九屆全國遺傳病診斷與產(chǎn)前診斷學(xué)術(shù)交流會暨產(chǎn)前診斷和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)新技術(shù)研討會論文集[C];2014年

4 倪培相;;新一代高通量測序技術(shù)在微生物基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[A];2010年中國科學(xué)院微生物研究所博士后學(xué)術(shù)年會暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

5 王楷[，

本文編號：1070174