本文關(guān)鍵詞：乳腺癌血清microRNA表達(dá)譜差異分析及其功能驗證

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【摘要】：目的：以臨床確診的乳腺癌患者和正常體檢人員為對象,研究兩者血清中miRNAs的表達(dá)譜差異,通過篩選驗證,獲得乳腺癌血清特異性目的miRNAs,加快血清miRNA作為biomarker向臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用進(jìn)程,為乳腺癌的診斷治療提供了新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,同時對miRNA在乳腺癌中的功能進(jìn)行初步研究,為miRNA乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用機制研究奠定基礎(chǔ)。方法：選取10例確診的乳腺癌病人和10例正常人樣本,利用高通量測序?qū)?0對乳腺癌病理組織、旁組織、血清和正常人血清進(jìn)行miRNA測序,并利用TargetScan、 Clip-seq等數(shù)據(jù)庫篩選出在乳腺癌中特異表達(dá)的miRNAs;利用實時熒光定量RT-PCR對篩選結(jié)果進(jìn)行大樣本血清驗證,利用SPSS統(tǒng)計分析,篩選出差異性表達(dá)的目的miRNAs,設(shè)計合成miRNA抑制劑,轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MB-435、MB-468,利用CCK8檢測乳腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor后的活力,利用TargetScan miRanda預(yù)測具有功能表達(dá)的miRNA靶基因,為功能研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)果：1.分析乳腺癌病理組織、旁組織和正常人血清的miRNA高通量測序測序結(jié)果,通過對不同樣本的Clean data的比較,分析其共有Reads以及特有的Reads,以log2(Fold Change)=1、P-value0.01為差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn),在986條差異表達(dá)中篩選出28個差異性表達(dá)的miRNAs,包括hsa-miR-144-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-let-7i-5p、 hsa-miR-323-5p、hsa-miR-110a-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-326-5p、 hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-195a-5p、 hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-374-5p、hsa-miR-26a、 hsa-miR-23-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-143、hsa-miR-30a、hsa-miR-126、 hsa-miR-125b、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-99a、hsa-miR-451a、 hsa-miR-320a、hsa-miR-223-3p。2.以差異表達(dá)量大于2倍以上,RT-PCR中CT值小于30作為標(biāo)準(zhǔn),共篩選出4條特異目的miRNAs,即hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a進(jìn)行血清學(xué)表達(dá)驗證分析。3.在113例乳腺癌患者以及104例健康對照組血清中對目標(biāo)miRNAs表達(dá)進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明miRNAs在血清中穩(wěn)定表達(dá),乳腺癌組與對照組相比,hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p及hsa-miR-320a相對表達(dá)量上調(diào),乳腺癌患者血清中4個目標(biāo)miRNAs的表達(dá)情況與前期乳腺癌組織中的表達(dá)情況一致,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),目的miRNAs的表達(dá)與臨床病理特征存在一定相關(guān)性。4.我們選取測序結(jié)果中和驗證的目的miRNAs,利用CCK8檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-223-3p inhibitor在MDA-MB-468中抑制miR-223-3p的表達(dá),從而抑制MDA-MB-468的活力；同時,miR-423-5p inhibitor在MDA-MB-468和MDA-MB-453中同時抑制這兩種細(xì)胞活力表達(dá),提示miR-223-3p、miR-423-5p對乳腺癌細(xì)胞活性存在調(diào)控作用,具有抑制抑癌基因的功能；另利用TargetScan、miRanda兩個數(shù)據(jù)庫對miR-223-3p、miR-423-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測,為下一步乳腺癌特異miRNA的功能研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)論：本課題選取乳腺癌組織、癌旁組織以及乳腺癌血清和正常人血清為研究對象,利用新一代高通量測序篩選出差異表達(dá)的miRNAs,初步建立了乳腺癌特異性的miRNAs差異表達(dá)譜。在對測序結(jié)果中表達(dá)上調(diào)的miR-374a-5p、miR-223-3p、miR-423-5p、 miR-320a血清學(xué)驗證發(fā)現(xiàn),其在血清和組織中的表達(dá)趨勢一致,并與臨床病理存在著關(guān)聯(lián),有可能作為乳腺癌診斷的潛在標(biāo)志物；在利用CCK-8檢測4個上調(diào)的miRNAs的功能中發(fā)現(xiàn),miR-223-3p、miR-423-5p在乳腺癌細(xì)胞中具有功能表達(dá),可能發(fā)揮著抑制抑癌基因的作用,影響著乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,為miRNA在乳腺癌中的功能研究提供線索。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 表達(dá)譜分析 差異表達(dá) 功能分析
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-14
• 1.1 乳腺癌的現(xiàn)狀10-11
• 1.1.1 乳腺癌發(fā)展現(xiàn)狀10
• 1.1.2 乳腺癌診斷現(xiàn)狀及存在問題10-11
• 1.1.3 乳腺癌研究新進(jìn)展11
• 1.2 microRNA11-13
• 1.2.1 miRNA的生物合成12
• 1.2.2 miRNA與腫瘤12-13
• 1.2.3 miRNA在乳腺癌中的研究進(jìn)展13
• 1.2.4 miRNA標(biāo)志物在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用13
• 1.3 MIRNA研究思路及新機遇13-14
• 第一部分 miRNA高通量測序及表達(dá)差異篩選14-24
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 主要儀器14-15
• 1.1.2 主要試劑15
• 1.1.3 主要試劑制備15
• 1.2 研究對象與方法15-18
• 1.2.1 研究對象15-16
• 1.2.2 標(biāo)本處理16
• 1.2.3 RNA提取16-17
• 1.2.4 高通量測序17-18
• 1.3 實驗結(jié)果分析18-22
• 1.3.1 RNA質(zhì)量檢測電泳結(jié)果18
• 1.3.2 測序結(jié)果分析18-20
• 1.3.3 結(jié)果20-22
• 1.4 討論22-24
• 第二部分 乳腺癌差異性miRNA血清學(xué)驗證24-32
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 主要儀器24-25
• 2.1.2 主要試劑25
• 2.1.3 引物設(shè)計25
• 2.2 實驗對象及標(biāo)本處理25-26
• 2.2.1 實驗對象25-26
• 2.2.2 標(biāo)本處理26
• 2.3 實驗方法26-28
• 2.3.1 血清miRNA提取26-27
• 2.3.2 miRNA cDNA第一鏈合成27-28
• 2.3.3 miRNA熒光定量PCR28
• 2.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計28
• 2.4 結(jié)果28-31
• 2.4.1 血清循環(huán)miRNA的RT-PGR檢測28-30
• 2.4.2 實驗組和對照組血清中miRNA表達(dá)情況分析30-31
• 2.5 討論31-32
• 第三部分 miR-223、miR-423-5P在乳腺癌中功能的初步研究32-38
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 主要儀器32
• 3.1.2 主要試劑32-33
• 3.2 實驗方法33-34
• 3.2.1 乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)33
• 3.2.2 MDA-MB-453、MDA-MB-468細(xì)胞轉(zhuǎn)染33-34
• 3.2.3 miRNA-223-3p inhibitor、miR-423-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后的檢測34
• 3.2.4 miR-223靶基因預(yù)測及功能分析34
• 3.3 實驗結(jié)果34-36
• 3.3.1 MDA-MB-453、MDA-MB-468細(xì)胞培養(yǎng)34
• 3.3.2 CCK8檢測miRNA對乳腺癌細(xì)胞生長活力的影響34-35
• 3.3.3 miR-223-3p、miR-423-5p靶基因預(yù)測及分類35-36
• 3.4 討論36-38
• 結(jié)語38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 附錄41-48
• 附錄1：英文縮寫詞41-42
• 附錄2：綜述42-48
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 在校期間發(fā)表論文情況48-49
• 致謝49-50
• 統(tǒng)計學(xué)審核證明50

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本文編號：1065397