本文關(guān)鍵詞：砷通過誘導HepG2細胞線粒體自噬抑制細胞增殖的機制研究

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【摘要】：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一。目前的治療手段主要依靠化學療法,然而可用藥物種類有限,治療過程中易產(chǎn)生耐藥性,作用機理研究不完善等因素在很大程度上限制著HCC的療效。自三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)成功地應(yīng)用于治療急性早幼粒白血病以來,其在臨床治療多種實體瘤中所展現(xiàn)的作用引起了國內(nèi)外學者的極大興趣。近年來研究發(fā)現(xiàn),As2O3能通過減少血管再生、抑制細胞增殖、降低細胞侵襲轉(zhuǎn)移風險、誘導細胞凋亡和自噬等途徑對肝癌起到一定的治療作用。其中,抑制細胞增殖是As203致肝癌細胞毒性的最基本作用途徑。線粒體作為真核細胞內(nèi)的重要細胞器,其結(jié)構(gòu)、功能、數(shù)量的改變在調(diào)控腫瘤細胞增殖方面具有多重作用,同時它也是砷發(fā)揮毒性作用的主要靶位點,而As2O3能否通過線粒體途徑來抑制細胞增殖及其可能的作用機制目前尚未可知。本研究以人肝癌細胞HepG2為實驗材料,通過MTT法、細胞克隆形成分析、實時熒光定量PCR、透射電鏡觀察、蛋白免疫印跡、細胞免疫熒光、熒光染色原位標記等技術(shù)手段,探究As203對細胞增殖及線粒體自噬各時期典型事件的影響,結(jié)合特異性線粒體自噬抑制劑,環(huán)孢霉素A (cycbsporin, CsA)和線粒體分裂抑制劑-1 (mitochondrial division inhibitor-1, Mdivi-1)的使用,及對細胞增殖誘導型酶,環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)作用機制的研究,闡明As203通過誘導線粒體自噬途徑對細胞增殖的抑制效應(yīng)及相關(guān)機制。以期為臨床使用As203作為抗腫瘤藥物提供相關(guān)研究背景及毒理學依據(jù)。研究結(jié)果顯示：1.As2O3 (2、4、8μM)暴露12、24、36 h后,細胞活力呈濃度、時間依賴性降低(P0.05),表明本研究所用劑量、時間范圍內(nèi)的As203己對HepG2細胞產(chǎn)生毒性作用；2.不同濃度As203處理細胞相同時間或相同濃度(4 μM)As2O3處理細胞不同時間后,細胞生長速度、細胞克隆形成能力以及細胞增殖活性(細胞增殖活性標記物Ki-67 mRNA表達量)均隨著濃度的升高或時間的延長而降低(P0.05),但各處理組中均未發(fā)生細胞凋亡(P0.05),表明本研究所用As203作用劑量、時間范圍內(nèi),HepG-2細胞增殖呈濃度、時間依賴性降低且與細胞凋亡無關(guān)；3.4μM As2O3處理細胞12、24 h后,誘導細胞內(nèi)形成線粒體自噬體及線粒體自噬溶酶體；進一步研究發(fā)現(xiàn),As2O3暴露后線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1的蓄積量和LC3 Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化率呈濃度、時間依賴性升高(P0.05),同時線粒體與溶酶體焦點增多；相反,線粒體內(nèi)膜蛋白COXⅣ表達量呈濃度、時間依賴性降低(P0.05),表明在本研究所用暴露濃度、時間范圍內(nèi),As2O3誘導3epG2細胞發(fā)生線粒體自噬,且發(fā)生程度呈濃度、時間依賴性加強,導致線粒體總量隨之減少；4.與4 μMAs2O3單獨處理組相比,線粒體自噬抑制劑CsA(5 μM)/Mdivi-1(15 μM)預處理細胞2h后,PINK1蓄積量和LC3Ⅱ/Ⅰ比率降低,COX Ⅳ表達量升高,表明As2O3誘導的線粒體自噬受到抑制(P0.05)；與此同時,Ki-67mRNA表達量升高(P0.05),說明在As2O3脅迫下,線粒體自噬發(fā)生從而抑制細胞增殖；5.As2O3暴露后,COX-2蛋白和mRNA表達水平均降低(P0.05)；COX-2抑制劑NS398(100 μM)單獨處理細胞后,Ki-67 mRNA表達量極顯著地降低(P0.01),進一步證明了COX-2在As2O3抑制細胞增殖的過程中起重要的正向調(diào)控作用；6.與As2O3單獨處理組相比,在CsA/Mdivi-1預處理組中COX-2蛋白水平顯著恢復(P0.05),說明線粒體自噬能夠減少COX-2蛋白在細胞內(nèi)的富集；通過熒光共聚焦顯微鏡觀測顯示COX-2主要定位于線粒體外膜,只有少部分分布在細胞質(zhì)中,As2O3暴露后,線粒體外膜及細胞質(zhì)中的COX-2蛋白水平均減少；CsA預處理后,兩部分的COX-2蛋白水平顯著增加并超過相應(yīng)對照組的水平,與之相反Mdivi-1預處理后,線粒體上的COX-2蛋白水平減少,細胞質(zhì)中的無明顯變化；COX-2 mRNA表達量在CsA/Mdivi-1預處理組較As2O3單獨處理組極顯著升高(P0.01)；結(jié)合兩種線粒體自噬抑制劑的作用機理,以上結(jié)果表明大量位于線粒體上的COX-2隨著特異性地線粒體自噬性降解而被降解,同時線粒體自噬的發(fā)生還可抑制COX-2的轉(zhuǎn)錄翻譯過程。綜上所述,本研究表明,As2O3通過誘導HepG2細胞發(fā)生線粒體自噬,降低細胞內(nèi)COX-2蛋白水平,從而抑制HepG2細胞增殖。在此過程中伴隨著線粒體特異性的自噬性清除,定位于線粒體上的COX-2也隨之降解,且線粒體自噬對COX-2的表達過程具有抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：三氧化二砷 細胞增殖 線粒體自噬 環(huán)氧合酶-2 HepG2
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 前言11-22
• 1.1 肝癌11-12
• 1.2 三氧化二砷12-14
• 1.2.1 三氧化二砷簡介12
• 1.2.2 三氧化二砷在腫瘤治療方面的研究進展12-14
• 1.3 線粒體14-15
• 1.3.1 線粒體簡介14
• 1.3.2 線粒體是砷發(fā)揮細胞毒性的重要靶位點14-15
• 1.4 線粒體自噬15-18
• 1.4.1 自噬與線粒體自噬15-16
• 1.4.2 PINK1-Parkin信號通路介導的線粒體自噬分子途徑16-17
• 1.4.3 線粒體自噬與細胞增殖17-18
• 1.5 環(huán)氧合酶-218-20
• 1.5.1 環(huán)氧合酶-2概述18
• 1.5.2 環(huán)氧合酶-2調(diào)控細胞增殖18-19
• 1.5.3 環(huán)氧合酶2與線粒體自噬19-20
• 1.6 研究目的及意義20
• 1.7 實驗技術(shù)路線20-22
• 第二章 實驗材料與方法22-39
• 2.1 實驗材料22
• 2.2 主要試劑與儀器22-27
• 2.2.1 主要試劑22-23
• 2.2.2 主要儀器23-24
• 2.2.3 主要溶液配制24-27
• 2.3 實驗方法27-38
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)27-28
• 2.3.2 細胞活力檢測28-29
• 2.3.3 細胞生長曲線檢測以及繪制29
• 2.3.4 細胞克隆形成分析29
• 2.3.5 RNA的提取29-31
• 2.3.6 實時定量PCR檢測Ki-67及COX-2 mRNA表達量31-33
• 2.3.7 AV/PI檢測細胞凋亡33-34
• 2.3.8 透射電鏡檢測細胞內(nèi)線粒體自噬體的產(chǎn)生34
• 2.3.9 蛋白提取及定量34-36
• 2.3.10 蛋白免疫印跡實驗36-37
• 2.3.11 細胞免疫熒光實驗37-38
• 2.3.12 MTG/LTR雙染示蹤線粒體自噬體38
• 2.4 統(tǒng)計學分析38-39
• 第三章 研究結(jié)果39-53
• 3.1 As_2O_3對細胞活力的影響39-40
• 3.2 As_2O_3對細胞增殖以及凋亡的影響40-43
• 3.2.1 As_2O_3對細胞生長曲線的影響40
• 3.2.2 AS_2O_3對細胞克隆形成能力的影響40
• 3.2.3 As_2O_3對Ki-67 mRNA表達量的影響40-42
• 3.2.4 As_2O_3對細胞凋亡的影響42-43
• 3.3 As_2O_3對線粒體自噬的影響43-48
• 3.3.1 As_2O_3誘導線粒體自噬體產(chǎn)生43
• 3.3.2 As_2O_3誘導線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1蓄積43-44
• 3.3.3 As_2O_3誘導LC3由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化44-46
• 3.3.4 As_2O_3誘導線粒體通過自噬途徑降解46-48
• 3.4 抑制線粒體自噬對細胞增殖的影響48-49
• 3.5 COX-2介導線粒體自噬對細胞增殖的抑制作用49-53
• 3.5.1 COX-2參與As_2O_3抑增殖作用49-51
• 3.5.2 抑制線粒體自噬增加COX-2表達量51-53
• 第四章 討論53-58
• 4.1 As_2O_3對細胞增殖的影響53
• 4.2 As_2O_3誘導線粒體自噬發(fā)生及其對細胞增殖的影響作用53-56
• 4.3 COX-2介導As_2O_3通過線粒體自噬途徑抑制細胞增殖56-58
• 第五章 結(jié)論58-59
• 5.1 主要結(jié)論58
• 5.2 研究展望58-59
• 附錄59-61
• 附錄Ⅰ：qPCR擴增曲線、標準曲線及溶解曲線59-60
• 附錄Ⅱ：主要縮略詞60-61
• 參考文獻61-69
• 在學期間的研究成果69-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 孫玉濤;徐立紅;;自噬及其在癌細胞中作用機制的研究[J];中國細胞生物學學報;2012年06期

2 李劍萍;邵耘;陳國勝;何曉璞;劉翠霞;許海塵;周蘇明;孫為豪;;熊果酸和環(huán)氧化酶-2抑制劑對胃癌細胞增殖的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2009年03期

3 ;Morphological and functional changes of mitochondria in apoptotic esophageal carcinoma cells induced by arsenic trioxide[J];World Journal of Gastroenterology;2002年01期

4 李丹;崔久嵬;蒿姍姍;牛超;Aadil Yousif;李薇;;三氧化二砷對人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞的作用及機制研究[J];中國實驗診斷學;2012年11期

5 張海波;黃力建;朱燕娟;李勇;白建平;潘宗奇;孟凡哲;;三氧化二砷對原發(fā)性肝癌經(jīng)肝動脈化學治療栓塞術(shù)后血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J];國際病理科學與臨床雜志;2013年02期

6 戴朝六;趙陽;;原發(fā)性肝癌的綜合治療[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2014年02期

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本文編號：1057131