本文關(guān)鍵詞：miR-143-3p調(diào)控人骨肉瘤（OS）肺轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制

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【摘要】：目的:探討mi R-143-3p及其靶基因蛋白在調(diào)控人骨肉瘤(OS)細(xì)胞生物學(xué)行為及肺轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制,為開發(fā)mi RNA再表達(dá)技術(shù)靶向抑制OS肺轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。方法:(1)RT-PCR檢測(cè)OS細(xì)胞株MG63和HOS細(xì)胞中mi R-143-3p、mi R-411-5p和mi R-195-5p表達(dá)的不同。用上述三種mi RNA成熟體(mimics,M)分別轉(zhuǎn)染OS細(xì)胞株MG63和HOS細(xì)胞,通過MTT、劃痕、Transwell等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi RNA對(duì)OS增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。(2)激光粒度儀測(cè)定不同濃度mi RNA mimics/CS納米球懸液的平均粒徑;將不同濃度MNC/CS納米球懸液注射入裸鼠尾靜脈,或者將2mg/ml MNC/CS納米球懸液注射到裸鼠尾靜脈,于不同時(shí)間點(diǎn)處死裸鼠。活體成像儀觀察裸鼠肺部蓄積的熒光強(qiáng)度,顯示mi RNA mimics/CS納米球懸液的肺靶向性。(3)將OS細(xì)胞株原位種植到裸鼠脛骨骨髓腔內(nèi),統(tǒng)計(jì)OS肺轉(zhuǎn)移模型成瘤率,HE染色檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移情況。將裸鼠OS肺轉(zhuǎn)移模型分為兩組(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組),分別尾靜脈注射陰性對(duì)照mimics/CS納米球懸液和mi R-143-3p mimics/CS納米球懸液,持續(xù)給藥4周后,采用體積測(cè)量初步測(cè)定OS增殖的影響,HE染色檢測(cè)裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況。(4)使用Target Scan 6.1,Diana micro T4.0和MICRORNA.ORG生物信息軟件分析篩選與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的mi R-143-3p靶基因(ITGA6、ASAP3、CRELD1和MSI2)。將mi R-143-3p M轉(zhuǎn)染HOS細(xì)胞,提取蛋白,通過Western blot檢測(cè)mi R-143-3p靶基因蛋白表達(dá)水平。分別將對(duì)照組(MNC)與實(shí)驗(yàn)組(mi R-143-3p/CS)裸鼠新鮮肺臟組織勻漿,并提蛋白,采用Western blot檢測(cè)mi R-143-3p靶蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)RT-PCR結(jié)果顯示,在MG63和HOS細(xì)胞中mi R-143-3p表達(dá)量均顯著下降。MTT結(jié)果顯示mi R-143-3p對(duì)增殖無影響,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-143-3p抑制OS細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力,Transwell結(jié)果顯示mi R-143-3p抑制OS細(xì)胞株的侵襲能力。(2)激光粒度儀和活體成像儀結(jié)果顯示肺內(nèi)蓄積熒光最顯著的MNC/CS納米球懸液濃度為2mg/ml,粒徑大小為336.9nm,具有肺靶向性。(3)HOS細(xì)胞原位種植5周后所有裸鼠左側(cè)脛骨接種處出現(xiàn)局部隆起及腫脹,肺臟未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶;種植6周起所有裸鼠左側(cè)脛骨接種處出現(xiàn)腫塊,原位成瘤率為100%,且肺臟均出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。MG63細(xì)胞原位種植裸鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束仍未出現(xiàn)瘤塊及轉(zhuǎn)移灶。給藥結(jié)束時(shí),與MNC組裸鼠相比,M組裸鼠明顯跛行,且兩組原位瘤塊平均體積無明顯差異;HE染色結(jié)果顯示,MNC組均有肺轉(zhuǎn)移灶,M組大部分無肺轉(zhuǎn)移灶,有1只裸鼠存在肺轉(zhuǎn)移灶。(4)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出mi R-143-3p靶基因,發(fā)現(xiàn)與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因有4個(gè),分別為ASAP3、ITGA6、MSI2和CRELD1。Western blot結(jié)果顯示,HOS細(xì)胞中的ASAP3與MSI2蛋白表達(dá)顯著降低,ITGA6和CRELD1無變化。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組肺組織中的ASAP3與MSI2蛋白表達(dá)顯著降低,ITGA6和CRELD1無變化。結(jié)論:(1)通過RT-PCR、MTT、劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)成功篩選出低表達(dá)mi R-143-3p。結(jié)果表明mi R-143-3p抑制OS細(xì)胞株侵襲和轉(zhuǎn)移的作用,但對(duì)增殖無影響。(2)激光粒度儀和活體成像儀成功篩選出肺內(nèi)蓄積熒光最顯著的MNC/CS納米球懸液濃度為2mg/ml,粒徑大小為336.9nm,具有肺靶向性,可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尾靜脈注射藥物時(shí)的載體。(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-143-3p mimics/CS納米球懸液抑制OS肺轉(zhuǎn)移,表明mi R-143-3p具有抑制OS肺轉(zhuǎn)移的作用。(4)生物信息學(xué)篩選出肺轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因,通過Western blot方法,揭示了mi R-143-3p的增加導(dǎo)致了靶蛋白ASAP3和MSI2在體內(nèi)外的減少,而ITGA6和CRELD1無變化。
【關(guān)鍵詞】：miRNA 骨肉瘤 肺轉(zhuǎn)移 miRNA-成熟體 ASAP3 MSI2
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 前言10-13
• 參考文獻(xiàn)11-13
• 第一部分miRNA調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究13-27
• 材料和方法13-19
• 結(jié)果19-24
• 討論24-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第二部分miR1433p mimics/殼聚糖（CS）納米球?qū)S肺轉(zhuǎn)移的影響27-40
• 材料和方法27-33
• 結(jié)果33-37
• 討論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 第三部分 骨肉瘤中miR1433p的靶蛋白的表達(dá)40-49
• 材料和方法40-44
• 結(jié)果44-46
• 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 結(jié)論49-50
• 綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 縮略詞表58-59
• 發(fā)表和待發(fā)表的論文59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 林峰;湯麗娜;姚陽;;骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移71例生存分析[J];腫瘤;2009年05期

2 Xiao-Li Wu;Bin Cheng;Pei-Yuan Li;Huan-Jun Huang;Qiu Zhao;Zi-Li Dan;Dean Tian;Peng Zhang;;MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

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本文編號(hào)：1052419