發(fā)布時間：2017-10-18 02:26

  本文關鍵詞：miR-143-3p調控人骨肉瘤（OS）肺轉移的分子機制

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【摘要】：目的:探討mi R-143-3p及其靶基因蛋白在調控人骨肉瘤(OS)細胞生物學行為及肺轉移中的分子機制,為開發(fā)mi RNA再表達技術靶向抑制OS肺轉移提供新的理論依據(jù)。方法:(1)RT-PCR檢測OS細胞株MG63和HOS細胞中mi R-143-3p、mi R-411-5p和mi R-195-5p表達的不同。用上述三種mi RNA成熟體(mimics,M)分別轉染OS細胞株MG63和HOS細胞,通過MTT、劃痕、Transwell等實驗檢測mi RNA對OS增殖、轉移和侵襲能力的影響。(2)激光粒度儀測定不同濃度mi RNA mimics/CS納米球懸液的平均粒徑;將不同濃度MNC/CS納米球懸液注射入裸鼠尾靜脈,或者將2mg/ml MNC/CS納米球懸液注射到裸鼠尾靜脈,于不同時間點處死裸鼠�；铙w成像儀觀察裸鼠肺部蓄積的熒光強度,顯示mi RNA mimics/CS納米球懸液的肺靶向性。(3)將OS細胞株原位種植到裸鼠脛骨骨髓腔內,統(tǒng)計OS肺轉移模型成瘤率,HE染色檢測肺轉移情況。將裸鼠OS肺轉移模型分為兩組(對照組和實驗組),分別尾靜脈注射陰性對照mimics/CS納米球懸液和mi R-143-3p mimics/CS納米球懸液,持續(xù)給藥4周后,采用體積測量初步測定OS增殖的影響,HE染色檢測裸鼠肺轉移情況。(4)使用Target Scan 6.1,Diana micro T4.0和MICRORNA.ORG生物信息軟件分析篩選與肺轉移相關的mi R-143-3p靶基因(ITGA6、ASAP3、CRELD1和MSI2)。將mi R-143-3p M轉染HOS細胞,提取蛋白,通過Western blot檢測mi R-143-3p靶基因蛋白表達水平。分別將對照組(MNC)與實驗組(mi R-143-3p/CS)裸鼠新鮮肺臟組織勻漿,并提蛋白,采用Western blot檢測mi R-143-3p靶蛋白的表達水平。結果:(1)RT-PCR結果顯示,在MG63和HOS細胞中mi R-143-3p表達量均顯著下降。MTT結果顯示mi R-143-3p對增殖無影響,劃痕實驗結果顯示mi R-143-3p抑制OS細胞株的轉移能力,Transwell結果顯示mi R-143-3p抑制OS細胞株的侵襲能力。(2)激光粒度儀和活體成像儀結果顯示肺內蓄積熒光最顯著的MNC/CS納米球懸液濃度為2mg/ml,粒徑大小為336.9nm,具有肺靶向性。(3)HOS細胞原位種植5周后所有裸鼠左側脛骨接種處出現(xiàn)局部隆起及腫脹,肺臟未出現(xiàn)轉移灶;種植6周起所有裸鼠左側脛骨接種處出現(xiàn)腫塊,原位成瘤率為100%,且肺臟均出現(xiàn)轉移灶。MG63細胞原位種植裸鼠至實驗結束仍未出現(xiàn)瘤塊及轉移灶。給藥結束時,與MNC組裸鼠相比,M組裸鼠明顯跛行,且兩組原位瘤塊平均體積無明顯差異;HE染色結果顯示,MNC組均有肺轉移灶,M組大部分無肺轉移灶,有1只裸鼠存在肺轉移灶。(4)生物信息學預測出mi R-143-3p靶基因,發(fā)現(xiàn)與肺轉移相關的靶基因有4個,分別為ASAP3、ITGA6、MSI2和CRELD1。Western blot結果顯示,HOS細胞中的ASAP3與MSI2蛋白表達顯著降低,ITGA6和CRELD1無變化。對照組和實驗組肺組織中的ASAP3與MSI2蛋白表達顯著降低,ITGA6和CRELD1無變化。結論:(1)通過RT-PCR、MTT、劃痕和Transwell實驗成功篩選出低表達mi R-143-3p。結果表明mi R-143-3p抑制OS細胞株侵襲和轉移的作用,但對增殖無影響。(2)激光粒度儀和活體成像儀成功篩選出肺內蓄積熒光最顯著的MNC/CS納米球懸液濃度為2mg/ml,粒徑大小為336.9nm,具有肺靶向性,可用于體內實驗尾靜脈注射藥物時的載體。(3)體內實驗驗證mi R-143-3p mimics/CS納米球懸液抑制OS肺轉移,表明mi R-143-3p具有抑制OS肺轉移的作用。(4)生物信息學篩選出肺轉移相關靶基因,通過Western blot方法,揭示了mi R-143-3p的增加導致了靶蛋白ASAP3和MSI2在體內外的減少,而ITGA6和CRELD1無變化。
【關鍵詞】：miRNA 骨肉瘤 肺轉移 miRNA-成熟體 ASAP3 MSI2
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 前言10-13
• 參考文獻11-13
• 第一部分miRNA調控骨肉瘤細胞生物學行為的研究13-27
• 材料和方法13-19
• 結果19-24
• 討論24-25
• 參考文獻25-27
• 第二部分miR1433p mimics/殼聚糖（CS）納米球對OS肺轉移的影響27-40
• 材料和方法27-33
• 結果33-37
• 討論37-38
• 參考文獻38-40
• 第三部分 骨肉瘤中miR1433p的靶蛋白的表達40-49
• 材料和方法40-44
• 結果44-46
• 討論46-47
• 參考文獻47-49
• 結論49-50
• 綜述50-58
• 參考文獻53-58
• 縮略詞表58-59
• 發(fā)表和待發(fā)表的論文59-60
• 致謝60-61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 林峰;湯麗娜;姚陽;;骨肉瘤肺轉移71例生存分析[J];腫瘤;2009年05期

2 Xiao-Li Wu;Bin Cheng;Pei-Yuan Li;Huan-Jun Huang;Qiu Zhao;Zi-Li Dan;Dean Tian;Peng Zhang;;MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

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本文編號：1052419