發(fā)布時(shí)間：2017-10-17 03:31

  本文關(guān)鍵詞：重組人β防御素-2抗胃癌BGC823活性研究

  更多相關(guān)文章： 人β防御素-2 基因重組 抗瘤活性 胃癌BGC823

【摘要】：人p防御素-2(hBD2),是一種普遍表達(dá)在人體上皮組織的內(nèi)源性抗微生物肽。有著廣譜高效的抗微生物作用,具有機(jī)體免疫應(yīng)答、化學(xué)趨化及其他蛋白酶的協(xié)同作用,但關(guān)于人β防御素與腫瘤之間的確切關(guān)系仍未見(jiàn)到研究文獻(xiàn)報(bào)道。胃癌已成為當(dāng)前威脅人類(lèi)健康的第二大惡性腫瘤,傳統(tǒng)的治療手段不能很好的解決胃癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的問(wèn)題,尋找安全高效的治療手段已經(jīng)成為目前急需要處理的問(wèn)題。目的：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-hBD2,并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于胃癌細(xì)胞株(BGC823)與正常人胃粘膜細(xì)胞(GES-1)中。檢測(cè)相對(duì)高表達(dá)hBD2對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC823的活性影響,并初步探討其機(jī)理。方法：利用分子生物學(xué)方法重組pCMV-hBD2真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染于胃癌細(xì)胞株(BGC823)與正常人胃粘膜細(xì)胞(GES-1)內(nèi)。在瞬時(shí)表達(dá)期間,用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢驗(yàn)hBD2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。并運(yùn)用MTS法、克隆存活實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲小室實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其對(duì)BGC823細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲功能的影響。同時(shí)通過(guò)熒光定量PCR和Western blotting檢驗(yàn)MMP2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果：重組載體經(jīng)核酸序列測(cè)序后,證實(shí)接入目的基因hBD2片段方向正確,基因序列與基因庫(kù)所報(bào)道核苷酸序列相符。檢測(cè)到轉(zhuǎn)染hBD2細(xì)胞組,其hBD2相對(duì)表達(dá)量顯著高于其余組。BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染hBD2組較于其他組,增殖和克隆形成顯著性降低,但正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖未受影響。觀察到轉(zhuǎn)染hBD2的BGC823細(xì)胞組較于其他組,遷移和侵襲的活性被明顯抑制。并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hBD2的BGC823細(xì)胞MMP2相對(duì)表達(dá)量顯著下降。結(jié)論：成功構(gòu)建hBD2的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-hBD2; hBD2顯著抑制胃癌BGC823細(xì)胞增殖、克隆過(guò)程,但不影響正常細(xì)胞GES-1增殖；hBD2還有效降低BGC823細(xì)胞的遷移和侵襲功能；hBD2的抑制BGC823的這種作用可能是通過(guò)抑制MMP2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：人β防御素-2 基因重組 抗瘤活性 胃癌BGC823
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-9
• 第一章 前言9-15
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料15-23
• 2.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備16-17
• 2.4 引物設(shè)計(jì)17-18
• 2.5 主要試劑以及配置18-23
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法23-41
• 3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-hBD2重組23-30
• 3.1.1 菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)23-24
• 3.1.2 DNA質(zhì)粒提取24-25
• 3.1.3 雙酶切反應(yīng)25
• 3.1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳后目的產(chǎn)物回收25-27
• 3.1.5 連接反應(yīng)27
• 3.1.6 轉(zhuǎn)化27-28
• 3.1.7 重組質(zhì)粒DNA獲取28-29
• 3.1.8 重組質(zhì)粒pCMV-hBD2檢測(cè)29-30
• 3.1.9 菌株凍存30
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)30-32
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)前準(zhǔn)備30
• 3.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇30-31
• 3.2.3 細(xì)胞傳代31
• 3.2.4 細(xì)胞凍存31-32
• 3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染32-33
• 3.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備32
• 3.3.2 轉(zhuǎn)染溶液配置32
• 3.3.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染32-33
• 3.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR33-35
• 3.4.1 各細(xì)胞總RNA提取33
• 3.4.2 RNA濃度測(cè)定33
• 3.4.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA33-34
• 3.4.4 熒光定量PCR34-35
• 3.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)35
• 3.5.1 細(xì)胞準(zhǔn)備35
• 3.5.2 MTS法檢測(cè)35
• 3.6 腫瘤細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)35-36
• 3.6.1 克隆細(xì)胞培養(yǎng)35-36
• 3.6.2 結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)36
• 3.7 Transwell遷移及侵襲小室36-37
• 3.7.1 腫瘤細(xì)胞饑餓處理36
• 3.7.2 腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)鋪膠36
• 3.7.3 腫瘤遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)36
• 3.7.4 結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)36-37
• 3.8 Western blotting37-40
• 3.8.1 細(xì)胞總蛋白提取37
• 3.8.2 BCA法測(cè)定蛋白定量37-38
• 3.8.3 制膠38
• 3.8.4 蛋白電泳38
• 3.8.5 電轉(zhuǎn)移38-39
• 3.8.6 免疫印記39
• 3.8.7 Western blotting結(jié)果分析39-40
• 3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 4.1 重組真核表達(dá)載體pCMV-hBD241
• 4.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hBD2表達(dá)情況41-42
• 4.2.1 mRNA水平檢測(cè)hBD2表達(dá)情況41-42
• 4.2.2 蛋白水平檢測(cè)hBD2表達(dá)情況42
• 4.3 hBD2對(duì)細(xì)胞增殖及克隆的影響42-43
• 4.3.1 hBD2對(duì)細(xì)胞增殖的影響42
• 4.3.2 hBD2對(duì)細(xì)胞克隆的影響42-43
• 4.4 hBD2對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲的影響43-44
• 4.4.1 hBD2對(duì)BGC823遷移的影響43
• 4.4.2 hBD2對(duì)BGC823侵襲的影響43-44
• 4.5 檢測(cè)影響對(duì)胃腺癌BGC823細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響44-45
• 4.5.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MMP2表達(dá)44
• 4.5.2 Western blotting檢測(cè)hBD2對(duì)MMP2表達(dá)情況44-45
• 第五章 討論45-48
• 第六章 結(jié)論48-49
• 第七章 參考文獻(xiàn)49-54
• 第八章 圖片附錄54-66
• 在校期間的研究成果66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 段紀(jì)俊;陳萬(wàn)青;張思維;;中國(guó)惡性腫瘤死亡率的國(guó)際比較[J];中國(guó)社會(huì)醫(yī)學(xué)雜志;2009年06期

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本文編號(hào)：1046574