本文關鍵詞：吳茱萸堿通過SIRT1影響人結腸癌細胞增殖和遷移的實驗研究

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【摘要】：結腸癌作為一種常見的胃腸道惡性腫瘤,其發(fā)病率居全球常見惡性腫瘤的第三位。目前臨床上治療結腸癌的首選方法為手術切除并輔以化療,盡管化療對癌細胞有直接的殺滅作用,但也會對正常細胞造成一定的損傷且易于復發(fā),部分病人因承受不了化療的痛苦而放棄治療甚至因化療致死。因而尋找一種新型低毒高效的抗結腸癌藥物迫在眉睫。吳茱萸堿(Evodiamine,Evo)是從吳茱萸干燥果實中提取的生物堿,近年來的研究表明其對多種腫瘤細胞具有明顯的抗腫瘤藥物活性,但目前對人結腸癌細胞的作用及相關機制的報道較少。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1,SIRT1)是sirtuin家族中的組蛋白脫乙酰酶,它是酵母沉默信號調(diào)節(jié)因2(silencing information regulator 2,sir2)在人體中的類似物。SIRT1能夠依賴NAD+使多種蛋白質的賴氨酸殘基發(fā)生去乙�；�,隸屬于第III類去乙�；讣碨irtuin家族。SIRT1主要通過組蛋白H1上賴氨酸殘基k26脫乙�；�、組蛋白H3上賴氨酸殘基k9脫乙�；�、組蛋白H4上賴氨酸殘基k16脫乙�；饔脕硇揎椊M蛋白。有研究報道,SIRT1在前列腺癌、原發(fā)性結腸癌、急性髓性白血病中均明顯過表達。此外,SIRT1在鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌中也高表達。王澈等研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可以抑制人黑色素瘤A375 S2細胞SIRT1的表達。NF-кB(nuclear factor-kappa B)是一種細胞核轉錄因子,近幾年大量的研究表明,NF-кB與腫瘤細胞的發(fā)生、增殖、分化、凋亡、侵襲和轉移密切關系,因此備受廣大學者的關注。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠在NAD+的輔助下對NF-кB亞基脫乙酰化,脫乙�；腘F-кB無法與IкBα結合,其核定位信號無法暴露,難以進入細胞核內(nèi)與特定基因的啟動子區(qū)域(5-'GGGACTTTCC-3')結合,啟動促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移等的特定基因的轉錄。MMPs家族蛋白參與腫瘤的遷移過程。Wen等報道,SIRT1可誘導MMPs家族中MMP-9基因的轉錄和翻譯。另外也有報道稱,磷酸化的NF-кB可以直接與MMP-9啟動子結合從而調(diào)節(jié)核內(nèi)MMP-9的合成。既然SIRT1和NF-кB都與MMP-9有著密切關系,且MMP-9作為SIRT1和NF-кB共同的下游蛋白存在,因此,我們提出假設:SIRT1在NF-кB和MMP-9所致的腫瘤遷移中起到至關重要的作用。方法體外培養(yǎng)人結腸癌HCT-116和HT-29細胞株,分別加入Evo 1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1繼續(xù)培養(yǎng)48 h,CCK-8法檢測Evo對HCT-116和HT-29細胞生存活性的影響;Transwell法和劃痕法檢測Nampt(SIRT1)Evo對HCT-116和HT-29細胞體外遷移的影響;RT-PCR和Western Blot檢測不同濃度的Evo(1.5、3、6μmol·L-1)和Nampt(10μg·L-1)誘導HCT-116和HT-29細胞48h后,細胞中SIRT1、NF-кB、MMP-9蛋白的表達情況。將HCT-116細胞接種到4周齡的Balb/c裸小鼠右下腹部,荷瘤直徑生長到約0.5cm后,Evo(3mg/Kg)灌胃治療(每天一次),并監(jiān)測瘤體直徑及小鼠體重,治療22天后收集標本,計數(shù)結腸轉移瘤個數(shù);HE染色觀察荷瘤細胞的形態(tài)改變,免疫組化和Western Blot檢測SIRT1、NF-кB/P65、MMP-9蛋白的表達變化。結果1.不同濃度的Evo(1.5、3、6、12、24、48、96μmol·L-1)作用于HCT-116和HT-29細胞48h后,兩種細胞的增殖均受到明顯抑制(P0.05),且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性;且Evo能抑制HCT-116和HT-29細胞的遷移。2.Evo可明顯下調(diào)HCT-116和HT-29細胞內(nèi)SIRT1、MMP-9 m RNA和蛋白的表達,上調(diào)NF-кB m RNA和蛋白的表達。3.Evo組的荷瘤重(0.63±0.13)g,明顯低于模型組(3.00±0.57)g,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);Evo組的瘤體積(941.98±122.59)mm3顯著小于模型組(1563.48±240.90)mm3(P0.01);Evo組小鼠的體重(25.60±0.63)g明顯大于模型組(15.54±0.50)g,且有統(tǒng)計差異(P0.01)。HE染色結果顯示:在荷瘤小鼠體內(nèi),Evo能顯著加快荷瘤細胞中核的固縮,促進細胞凋亡。4.在體內(nèi)實驗,與模型組相比,Evo組小鼠瘤體組織中NF-кB表達增強,而SIRT1、MMP9表達降低。結論體內(nèi)外實驗表明,Evo對結腸癌細胞增殖和遷移的抑制作用是通過抑制SIRT1的表達,激活NF-кB信號通路,進而抑制MMP-9來實現(xiàn)的。
【關鍵詞】：吳茱萸堿 HCT-116 HT-29細胞 增殖 遷移
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-16
• 第一部分 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116 和HT-29 細胞體外增殖和轉移的影響及其作用機制的研究16-29
• 1 材料16-22
• 2 結果22-26
• 3 圖片26-29
• 第二部分 吳茱萸堿對人結腸癌HCT-116 細胞體內(nèi)遷移的影響及其作用機制的研究29-39
• 1 材料和方法29-32
• 2 結果32-35
• 3 圖片35-39
• 討論39-42
• 全文總結42-43
• 參考文獻43-46
• 文獻綜述：吳茱萸堿抗腫瘤活性的研究進展46-52
• 參考文獻49-52
• 致謝52-53
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文53

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本文編號：1042818