本文關鍵詞：HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的調控作用及其相關機制的研究

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【摘要】：背景：前列腺癌作為威脅男性健康的常見腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈現逐年上升的趨勢。目前,據有關報道,前列腺癌的發(fā)病率居全球男性所有惡性腫瘤發(fā)病率的第二位,死亡率居第五位。我國前列腺癌的發(fā)病率與死亡率雖比其他發(fā)達國家低很多,但近年來隨著社會的進步、人口的老齡化、人們飲食習慣的改變以及醫(yī)療條件的改善呈現明顯上升的趨勢,已嚴重威脅我國男性的身體健康。由于我國幅員遼闊,有很多地方的就醫(yī)環(huán)境不太理想,目前臨床上發(fā)現的晚期前列腺癌較多,盡管隨著我們國內醫(yī)生對前列腺癌認識的不斷提高,各種檢查手段,如PSA、B超檢查,以及不斷地宣傳,公眾對健康知識認知程度的提高,現在越來越多比較早期的前列腺癌患者被發(fā)現,但效果依舊不盡人意,在臨床治療方面也存在效果不佳的情況。目前前列腺癌的發(fā)病機制也不甚清楚。因此,對前列腺癌的發(fā)病機制進行深入的研究,尋找特異性和敏感性都較好的前列腺癌分子標志物以及有效的治療靶點,對我國前列腺的臨床診斷和治療都具有非常重要的科學研究價值。我國學者韓趙東等在最近研究中應用基因芯片以及雙向電泳和質譜分析的方法鑒定出了前列腺癌中的2566種腫瘤蛋白,進一步通過生物信息學分析發(fā)現了60個差異性表達的腫瘤蛋白,其中有37個表達上調,而23個表達下調。而其中在前列腺癌中表達存在明顯差異性的有14種基因及其蛋白產物(ACLY, CAPG,GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1 and VCL). HnRNP L全稱是核內不均一核糖核蛋白L,其系hnRNP家族的一員。人HnRNP L定位于19q13.2,全長1759bp,含有17個外顯子。有研究報道,hnRNP家族中的各成員在DNA損傷修復、轉錄、hnRNA剪接mRNA輸送、降解等生物過程中發(fā)揮著重要作用。核內不均一核糖核蛋白L(HnRNPL)最早是由Pinol-Roma S等在早期轉錄片段中意外發(fā)現的核糖核蛋白,這種蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,目前已知其與肺癌、肝癌、結直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切,而在本課題組前期研究中也發(fā)現其能夠影響生精細胞的增值和凋亡。已有研究報道hnRNP家族中的HnRNP K與前列腺癌有著緊密的關系,可能參與調控前列腺癌的增殖和凋亡,但HnRNP L與前列腺癌的關系罕見報道。本研究首先探討HnRNP L與前列腺癌患者的各項臨床指標之間的關系,進一步在體內外研究HnRNP L對前列腺癌增值、凋亡的影響并揭示其可能的分子機制,最終闡明HnRNP L在前列腺發(fā)生發(fā)展中可能扮演的角色,并為前列腺癌的臨床診斷和治療提供一種新的腫瘤分子標志物和治療靶點。目的：1探討HnRNP L與前列腺癌患者的各項臨床指標之間的關系；2通過體內外的功能實驗闡明HnRNP L與前列腺癌細胞增殖、凋亡的關系；3通過一系列分子生物學實驗最終揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能發(fā)揮的分子調控機制。方法：1 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達情況以及與各項臨床病理參數的關系于西安艾麗娜生物有限公司購得一包含81例前列腺增生癥樣本和99例前列腺癌樣本的組織芯片,通過免疫組化S-P法檢測各個樣本中HnRNP L的表達情況,并結合各樣本的各項臨床病理參數,用相關統計學方法進行關聯性分析；于南方醫(yī)院泌尿外科收集得10對前列腺癌和癌旁配對組織,進行組織研磨提取蛋白后進行WB檢測10對配對組織中HnRNP L的表達情況。2分別敲低和過表達HnRNP L在各前列腺細胞株中的表達,研究其對前列腺癌增殖、凋亡水平的影響首先,采用Q-PCR和WB檢測HnRNP L在三株前列腺癌細胞株(PC3、DU145、Lncap)中的表達情況,篩選HnRNP L表達較高和較低細胞株,對表達較高細胞株(DU145)進行慢病毒敲低處理,對表達較低細胞株(Lncap)進行慢病毒過表達處理,而對于中間表達細胞株(PC3)既進行敲低處理也進行過表達處理；進一步通過cck-8實驗、Transwell侵襲實驗、平板克隆形成實驗、裸鼠皮下成瘤實驗以及流式細胞術檢測HnRNP L敲低或過表達前后,前列腺癌細胞株增殖和凋亡情況的改變。3 HnRNP L調控前列腺癌細胞增殖和凋亡的可能的分子機制通過免疫熒光、CO-IP、RIP以及pull-down等實驗方法檢測HnRNP L與增殖、凋亡通路中可能相互作用的蛋白或基因,進一步通過WB檢測HnRNP L敲低和過表達前后增殖以及凋亡通路中各蛋白水平的改變,最終揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能的調控機制。結果：1 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達及其表達與臨床病理參數的關系1.1 HnRNP L與前列腺癌各項臨床病理參數的關系免疫組化檢測結果表明：在81例前列腺增生癥組織中HnRNP L的陽性表達率是29.63%(n=24),而在99例前列腺癌組織中HnRNP L的陽性表達率是84.8%(n=84),二者差異具有統計學意義(p0.05)；同時,結果也表明：在前列腺癌中,HnRNP L表達情況與臨床分期、病理分級呈正相關(p0.05)。隨后,Western blot檢測結果顯示HnRNP L在前列腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織。2分別敲低和過表達HnRNP L在各前列腺細胞株中的表達,研究其表達對前列腺癌細胞增殖及凋亡的影響2.1利用慢病毒技術構建穩(wěn)定轉染細胞株模型Q-PCR和Western blot結果顯示DU145細胞株中HnRNP L的表達水平最高,Lncap細胞株中HnRNP L的表達水平最低,而PC3細胞株中HnRNP L的表達水平居中,因此在后續(xù)實驗中對DU145細胞株僅做HnRNP L穩(wěn)定敲低的處理,對Lncap細胞株僅做HnRNP L穩(wěn)定過表達的處理,而對PC3細胞株既進行敲低HnRNP L的處理,也進行過表達HnRNP L的處理；轉染48h后,經WB檢測各株細胞敲低和過表達的效率,選擇構建成功的穩(wěn)轉細胞株模型用于后續(xù)的功能實驗。2.2敲低HnRNP L的表達對前列腺癌細胞株增殖能力的影響采用CCK-8細胞活性試驗檢測HnRNP L敲低后對DU145細胞株和PC3細胞株增殖能力的影響,并繪制生長曲線圖。統計學分析結果顯示：與對照組相比,DU145和PC3細胞株中敲低組細胞的增殖能力降低,差異具有顯著的統計學意義(p0.05),不同的時間點對DU145和PC3細胞株的增殖能力影響顯著(p0.05),各時間點組與處理組間交互效應顯著(p0.05)；平板克隆形成試驗結果顯示：DU145細胞株中敲低組和對照組的克隆形成率分別是42.3%和75.1%,而PC3細胞株中敲低組和對照組的克隆形成率分別是31.8%和67.5%,兩兩比較,差異顯著,具有統計學意義(p0.05)；流式細胞術對細胞周期的檢測結果顯示：DU145細胞株中敲低組和對照組的G1期細胞數百分比分別是53.62%和33.14%,S期細胞數百分比分別是30.37%和55.01%,而PC3細胞株中敲低組和對照組的G1期細胞數百分比分別是81.09%和40.13%,S期細胞數百分比分別是14.03%和28.37%,統計學分析表明DU145和PC3細胞株中敲低組和對照組的細胞數百分比具有統計學差異,提示敲低HnRNP L的表達后,前列腺癌細胞株的增殖能力受到抑制,可能是因為其細胞周期阻滯在G1期而導致。2.3過表達HnRNP L的表達對前列腺癌細胞株增殖能力的影響同理,CCK-8結果顯示：Lncap和PC3細胞株中過表達組較對照組的細胞增殖能力明顯增強,差異具有顯著的統計學意義(p0.05)；平板克隆形成試驗結果顯示：Lncap細胞株中過表達組和對照組的克隆形成率分別是33.6%和25.9%,而PC3細胞株中過表達組和對照組的克隆形成率分別是79.5%和51.6%,統計學分析表明Lncap和PC3細胞株中過表達組細胞的克隆形成能力明顯高于對照組,差異具有統計學意義(p0.05)；流式細胞術細胞周期檢測結果顯示：Lncap細胞株中過表達組和對照組的G1期細胞數百分比分別是45.60%和48.53%,S期細胞數百分比分別是36.65%和32.87%,而PC3細胞株中敲低組和對照組的G1期細胞數百分比分別是38.94%和36.48%,S期細胞數百分比分別是42.86%和27.55%,統計學分析表明過表達組和對照組差異明顯,具有統計學意義,提示HnRNP L過表達具有促進前列腺癌細胞增殖的能力,可能是因為其加快了細胞周期的進程。2.4敲低及過表達HnRNP L對腫瘤生長能力的影響裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示：PC3細胞株敲低組、對照組和過表達組腫瘤的大小差異明顯,具有統計學意義(p0.05),瘤體制成蠟塊并切片后經免疫組化檢測發(fā)現PC3細胞株敲低組、對照組和過表達組的腫瘤組織中增殖指標Ki-67的陽性表達率分別為10.1%、42.6%和69.2%,差異具有統計學意義(p0.05),提示：與對照組相比,敲低HnRNP L能抑制腫瘤的生長,而HnRNP L過表達能促進腫瘤的生長。2.5敲低和過表達HnRNP L對前列腺癌細胞凋亡情況的影響流式細胞術對細胞凋亡的檢測結果顯示：敲低HnRNP L后,DU145敲低組和對照組細胞的凋亡率分別是14.7%和7.7%,而PC3敲低組和對照組細胞的凋亡率分別是44.9%和15.5%,統計學分析表明敲低組和對照組細胞的凋亡率具有統計學差異,提示敲低HnRNP L表達具有促進前列腺癌細胞凋亡的能力。過表達HnRNP L后,Lncap細胞株中過表達組和對照組的凋亡率分別是13.2%和13.9%,而PC3細胞株中敲低組和對照組的凋亡率分別是9.0%和16.9%,統計學分析表明過表達組和對照組的凋亡率具有統計學差異,提示HnRNP L過表達抑制了前列腺癌細胞株的凋亡能力。3 HnRNP L調控前列腺癌細胞增殖及凋亡的分子機制免疫熒光結果提示HnRNP L和BCL-2在PC3細胞核內具有共定位現象,而CO-IP和pull-down結果更進一步證明HnRNP L與BCL-2之間存在相互作用的關系,而RIP結果顯示HnRNP L能與p53的mRNA相互作用進一步影響p53蛋白的表達,以上結果提示HnRNP L是分別通過調控p53和BCL-2的表達情況來影響前列腺癌細胞的增殖和凋亡能力。結論：研究結果表明HnRNP L在前列腺癌中是高表達的,并且其與前列腺癌的臨床分期和病理分級都密切相關。HnRNP L在前列腺癌中可能發(fā)揮著促進腫瘤細胞增殖和抗凋亡的作用,其作用機制可能與p53/p21/cyclin D1信號通路和bcl-2/caspase 9/caspase 3信號通路有關�？偟膩碚f,HnRNP L有望成為前列腺癌臨床診斷和治療的一種新的分子標志物和治療靶點。
【關鍵詞】：前列腺癌 增殖 凋亡 核內不均一核糖核蛋白L 分子機制
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 前言20-24
• 第一章 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達及其表達與臨床病理參數的關系24-33
• 一、材料和方法24-28
• 二、結果28-31
• 三、討論31-33
• 第二章 HnRNP L表達上調或下調后對前列腺癌增殖、凋亡等生物學特性的影響33-54
• 一、材料與方法33-40
• 二、結果40-52
• 三、討論52-54
• 第三章 HnRNP L調控前列腺癌細胞增殖和凋亡的分子機制的初步研究54-70
• 一、材料與方法54-60
• 二、結果60-66
• 三、討論66-70
• 全文總結70-72
• 參考文獻72-81
• 碩士期間發(fā)表論文情況81-82
• 致謝82-84

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1 周許敏;HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的調控作用及其相關機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

2 何金參;HnRNP L在前列腺癌中的功能研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1031187