本文關(guān)鍵詞：HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制的研究

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【摘要】：背景：前列腺癌作為威脅男性健康的常見腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前,據(jù)有關(guān)報道,前列腺癌的發(fā)病率居全球男性所有惡性腫瘤發(fā)病率的第二位,死亡率居第五位。我國前列腺癌的發(fā)病率與死亡率雖比其他發(fā)達(dá)國家低很多,但近年來隨著社會的進(jìn)步、人口的老齡化、人們飲食習(xí)慣的改變以及醫(yī)療條件的改善呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,已嚴(yán)重威脅我國男性的身體健康。由于我國幅員遼闊,有很多地方的就醫(yī)環(huán)境不太理想,目前臨床上發(fā)現(xiàn)的晚期前列腺癌較多,盡管隨著我們國內(nèi)醫(yī)生對前列腺癌認(rèn)識的不斷提高,各種檢查手段,如PSA、B超檢查,以及不斷地宣傳,公眾對健康知識認(rèn)知程度的提高,現(xiàn)在越來越多比較早期的前列腺癌患者被發(fā)現(xiàn),但效果依舊不盡人意,在臨床治療方面也存在效果不佳的情況。目前前列腺癌的發(fā)病機(jī)制也不甚清楚。因此,對前列腺癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究,尋找特異性和敏感性都較好的前列腺癌分子標(biāo)志物以及有效的治療靶點(diǎn),對我國前列腺的臨床診斷和治療都具有非常重要的科學(xué)研究價值。我國學(xué)者韓趙東等在最近研究中應(yīng)用基因芯片以及雙向電泳和質(zhì)譜分析的方法鑒定出了前列腺癌中的2566種腫瘤蛋白,進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了60個差異性表達(dá)的腫瘤蛋白,其中有37個表達(dá)上調(diào),而23個表達(dá)下調(diào)。而其中在前列腺癌中表達(dá)存在明顯差異性的有14種基因及其蛋白產(chǎn)物(ACLY, CAPG,GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1 and VCL). HnRNP L全稱是核內(nèi)不均一核糖核蛋白L,其系hnRNP家族的一員。人HnRNP L定位于19q13.2,全長1759bp,含有17個外顯子。有研究報道,hnRNP家族中的各成員在DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、hnRNA剪接mRNA輸送、降解等生物過程中發(fā)揮著重要作用。核內(nèi)不均一核糖核蛋白L(HnRNPL)最早是由Pinol-Roma S等在早期轉(zhuǎn)錄片段中意外發(fā)現(xiàn)的核糖核蛋白,這種蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,目前已知其與肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,而在本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)其能夠影響生精細(xì)胞的增值和凋亡。已有研究報道hnRNP家族中的HnRNP K與前列腺癌有著緊密的關(guān)系,可能參與調(diào)控前列腺癌的增殖和凋亡,但HnRNP L與前列腺癌的關(guān)系罕見報道。本研究首先探討HnRNP L與前列腺癌患者的各項臨床指標(biāo)之間的關(guān)系,進(jìn)一步在體內(nèi)外研究HnRNP L對前列腺癌增值、凋亡的影響并揭示其可能的分子機(jī)制,最終闡明HnRNP L在前列腺發(fā)生發(fā)展中可能扮演的角色,并為前列腺癌的臨床診斷和治療提供一種新的腫瘤分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目的：1探討HnRNP L與前列腺癌患者的各項臨床指標(biāo)之間的關(guān)系；2通過體內(nèi)外的功能實(shí)驗(yàn)闡明HnRNP L與前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系；3通過一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最終揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能發(fā)揮的分子調(diào)控機(jī)制。方法：1 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)情況以及與各項臨床病理參數(shù)的關(guān)系于西安艾麗娜生物有限公司購得一包含81例前列腺增生癥樣本和99例前列腺癌樣本的組織芯片,通過免疫組化S-P法檢測各個樣本中HnRNP L的表達(dá)情況,并結(jié)合各樣本的各項臨床病理參數(shù),用相關(guān)統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析；于南方醫(yī)院泌尿外科收集得10對前列腺癌和癌旁配對組織,進(jìn)行組織研磨提取蛋白后進(jìn)行WB檢測10對配對組織中HnRNP L的表達(dá)情況。2分別敲低和過表達(dá)HnRNP L在各前列腺細(xì)胞株中的表達(dá),研究其對前列腺癌增殖、凋亡水平的影響首先,采用Q-PCR和WB檢測HnRNP L在三株前列腺癌細(xì)胞株(PC3、DU145、Lncap)中的表達(dá)情況,篩選HnRNP L表達(dá)較高和較低細(xì)胞株,對表達(dá)較高細(xì)胞株(DU145)進(jìn)行慢病毒敲低處理,對表達(dá)較低細(xì)胞株(Lncap)進(jìn)行慢病毒過表達(dá)處理,而對于中間表達(dá)細(xì)胞株(PC3)既進(jìn)行敲低處理也進(jìn)行過表達(dá)處理；進(jìn)一步通過cck-8實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測HnRNP L敲低或過表達(dá)前后,前列腺癌細(xì)胞株增殖和凋亡情況的改變。3 HnRNP L調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的可能的分子機(jī)制通過免疫熒光、CO-IP、RIP以及pull-down等實(shí)驗(yàn)方法檢測HnRNP L與增殖、凋亡通路中可能相互作用的蛋白或基因,進(jìn)一步通過WB檢測HnRNP L敲低和過表達(dá)前后增殖以及凋亡通路中各蛋白水平的改變,最終揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：1 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系1.1 HnRNP L與前列腺癌各項臨床病理參數(shù)的關(guān)系免疫組化檢測結(jié)果表明：在81例前列腺增生癥組織中HnRNP L的陽性表達(dá)率是29.63%(n=24),而在99例前列腺癌組織中HnRNP L的陽性表達(dá)率是84.8%(n=84),二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；同時,結(jié)果也表明：在前列腺癌中,HnRNP L表達(dá)情況與臨床分期、病理分級呈正相關(guān)(p0.05)。隨后,Western blot檢測結(jié)果顯示HnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。2分別敲低和過表達(dá)HnRNP L在各前列腺細(xì)胞株中的表達(dá),研究其表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響2.1利用慢病毒技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株模型Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示DU145細(xì)胞株中HnRNP L的表達(dá)水平最高,Lncap細(xì)胞株中HnRNP L的表達(dá)水平最低,而PC3細(xì)胞株中HnRNP L的表達(dá)水平居中,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對DU145細(xì)胞株僅做HnRNP L穩(wěn)定敲低的處理,對Lncap細(xì)胞株僅做HnRNP L穩(wěn)定過表達(dá)的處理,而對PC3細(xì)胞株既進(jìn)行敲低HnRNP L的處理,也進(jìn)行過表達(dá)HnRNP L的處理；轉(zhuǎn)染48h后,經(jīng)WB檢測各株細(xì)胞敲低和過表達(dá)的效率,選擇構(gòu)建成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型用于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。2.2敲低HnRNP L的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞株增殖能力的影響采用CCK-8細(xì)胞活性試驗(yàn)檢測HnRNP L敲低后對DU145細(xì)胞株和PC3細(xì)胞株增殖能力的影響,并繪制生長曲線圖。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示：與對照組相比,DU145和PC3細(xì)胞株中敲低組細(xì)胞的增殖能力降低,差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),不同的時間點(diǎn)對DU145和PC3細(xì)胞株的增殖能力影響顯著(p0.05),各時間點(diǎn)組與處理組間交互效應(yīng)顯著(p0.05)；平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示：DU145細(xì)胞株中敲低組和對照組的克隆形成率分別是42.3%和75.1%,而PC3細(xì)胞株中敲低組和對照組的克隆形成率分別是31.8%和67.5%,兩兩比較,差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期的檢測結(jié)果顯示：DU145細(xì)胞株中敲低組和對照組的G1期細(xì)胞數(shù)百分比分別是53.62%和33.14%,S期細(xì)胞數(shù)百分比分別是30.37%和55.01%,而PC3細(xì)胞株中敲低組和對照組的G1期細(xì)胞數(shù)百分比分別是81.09%和40.13%,S期細(xì)胞數(shù)百分比分別是14.03%和28.37%,統(tǒng)計學(xué)分析表明DU145和PC3細(xì)胞株中敲低組和對照組的細(xì)胞數(shù)百分比具有統(tǒng)計學(xué)差異,提示敲低HnRNP L的表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞株的增殖能力受到抑制,可能是因?yàn)槠浼?xì)胞周期阻滯在G1期而導(dǎo)致。2.3過表達(dá)HnRNP L的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞株增殖能力的影響同理,CCK-8結(jié)果顯示：Lncap和PC3細(xì)胞株中過表達(dá)組較對照組的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示：Lncap細(xì)胞株中過表達(dá)組和對照組的克隆形成率分別是33.6%和25.9%,而PC3細(xì)胞株中過表達(dá)組和對照組的克隆形成率分別是79.5%和51.6%,統(tǒng)計學(xué)分析表明Lncap和PC3細(xì)胞株中過表達(dá)組細(xì)胞的克隆形成能力明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示：Lncap細(xì)胞株中過表達(dá)組和對照組的G1期細(xì)胞數(shù)百分比分別是45.60%和48.53%,S期細(xì)胞數(shù)百分比分別是36.65%和32.87%,而PC3細(xì)胞株中敲低組和對照組的G1期細(xì)胞數(shù)百分比分別是38.94%和36.48%,S期細(xì)胞數(shù)百分比分別是42.86%和27.55%,統(tǒng)計學(xué)分析表明過表達(dá)組和對照組差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示HnRNP L過表達(dá)具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖的能力,可能是因?yàn)槠浼涌炝思?xì)胞周期的進(jìn)程。2.4敲低及過表達(dá)HnRNP L對腫瘤生長能力的影響裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PC3細(xì)胞株敲低組、對照組和過表達(dá)組腫瘤的大小差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),瘤體制成蠟塊并切片后經(jīng)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞株敲低組、對照組和過表達(dá)組的腫瘤組織中增殖指標(biāo)Ki-67的陽性表達(dá)率分別為10.1%、42.6%和69.2%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),提示：與對照組相比,敲低HnRNP L能抑制腫瘤的生長,而HnRNP L過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長。2.5敲低和過表達(dá)HnRNP L對前列腺癌細(xì)胞凋亡情況的影響流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果顯示：敲低HnRNP L后,DU145敲低組和對照組細(xì)胞的凋亡率分別是14.7%和7.7%,而PC3敲低組和對照組細(xì)胞的凋亡率分別是44.9%和15.5%,統(tǒng)計學(xué)分析表明敲低組和對照組細(xì)胞的凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)差異,提示敲低HnRNP L表達(dá)具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的能力。過表達(dá)HnRNP L后,Lncap細(xì)胞株中過表達(dá)組和對照組的凋亡率分別是13.2%和13.9%,而PC3細(xì)胞株中敲低組和對照組的凋亡率分別是9.0%和16.9%,統(tǒng)計學(xué)分析表明過表達(dá)組和對照組的凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)差異,提示HnRNP L過表達(dá)抑制了前列腺癌細(xì)胞株的凋亡能力。3 HnRNP L調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制免疫熒光結(jié)果提示HnRNP L和BCL-2在PC3細(xì)胞核內(nèi)具有共定位現(xiàn)象,而CO-IP和pull-down結(jié)果更進(jìn)一步證明HnRNP L與BCL-2之間存在相互作用的關(guān)系,而RIP結(jié)果顯示HnRNP L能與p53的mRNA相互作用進(jìn)一步影響p53蛋白的表達(dá),以上結(jié)果提示HnRNP L是分別通過調(diào)控p53和BCL-2的表達(dá)情況來影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力。結(jié)論：研究結(jié)果表明HnRNP L在前列腺癌中是高表達(dá)的,并且其與前列腺癌的臨床分期和病理分級都密切相關(guān)。HnRNP L在前列腺癌中可能發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用,其作用機(jī)制可能與p53/p21/cyclin D1信號通路和bcl-2/caspase 9/caspase 3信號通路有關(guān)。總的來說,HnRNP L有望成為前列腺癌臨床診斷和治療的一種新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 增殖 凋亡 核內(nèi)不均一核糖核蛋白L 分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 前言20-24
• 第一章 HnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系24-33
• 一、材料和方法24-28
• 二、結(jié)果28-31
• 三、討論31-33
• 第二章 HnRNP L表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后對前列腺癌增殖、凋亡等生物學(xué)特性的影響33-54
• 一、材料與方法33-40
• 二、結(jié)果40-52
• 三、討論52-54
• 第三章 HnRNP L調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制的初步研究54-70
• 一、材料與方法54-60
• 二、結(jié)果60-66
• 三、討論66-70
• 全文總結(jié)70-72
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 碩士期間發(fā)表論文情況81-82
• 致謝82-84

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1 周許敏;HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 何金參;HnRNP L在前列腺癌中的功能研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號：1031187