本文關(guān)鍵詞：靶向IncRNA MALAT1的食管癌基因治療研究

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【摘要】：背景：近些年食管癌嚴(yán)重威脅了我國(guó)人民的生命健康,化療、手術(shù)和放療等治療方法的預(yù)后較差。新的治療方法是從基因?qū)用鎸で蟀┌Y解決方案,是目前研究的熱點(diǎn)之一,具體來(lái)講基因治療是利用病毒或者非病毒載體攜帶相關(guān)基因進(jìn)入細(xì)胞后影響生物學(xué)進(jìn)程,首先保證特定外源基因和基因載體結(jié)合緊密,避免被體外核酸酶降解,逃脫免疫系統(tǒng)破壞,然后內(nèi)吞入細(xì)胞,逃避細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解,最后目的基因進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用,導(dǎo)致致癌基因的沉默、抑癌基因的激活及腫瘤血管生成基因的抑制等,抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的基因治療具有安全性高、靶向性強(qiáng)且高效的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)取得的越來(lái)越多腫瘤病因的分子機(jī)制研究進(jìn)展,更加進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤基因治療這項(xiàng)新技術(shù)的應(yīng)用。本文基因治療涉及靶向的MALAT1是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA,在很多癌癥的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中有不同程度的上調(diào),基因治療靶向lnc RNA是通過(guò)miRNA的作用,miRNA是一種長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸非編碼單鏈RNA,本文中研究涉及的兩種分別是miR-101和miR-217,被發(fā)現(xiàn)在很多腫瘤中下調(diào)。目的：本文首次將新的基因載體PER-PGEA、帶葉酸配體的基因載體PER-PGEA-FA攜帶特定的miRNA進(jìn)入食管癌細(xì)胞中,靶向lncRNA MALAT1,并且研究對(duì)食管癌細(xì)胞的實(shí)際影響,為未來(lái)的體內(nèi)基因疾病治療提供了可能。方法：本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)思路之后,確定靶向促癌基因lncRNA MALAT1,分析確定可以靶向lncRNA的miR-101和miR-217,基因載體是利用合作實(shí)驗(yàn)室最新合成的陽(yáng)離子聚合物PER-PGEA和帶葉酸配體PER-PGEA-FA,首先通過(guò)綠色熒光蛋白實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),研究新基因載體和質(zhì)粒DNA結(jié)合條件,然后確定基因載體轉(zhuǎn)染能力,并研究基因載體和特定miRNA最佳絡(luò)合條件,通過(guò)測(cè)粒徑和電位初步判斷絡(luò)合的最佳氮磷比,MTT實(shí)驗(yàn)研究基因載體與miRNA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性,RT-qPCR測(cè)基因載體絡(luò)合miRNA后轉(zhuǎn)染在多種食管癌細(xì)胞中實(shí)際效率。接下來(lái)用RT-qPCR檢測(cè)基因載體攜帶特定miRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)hcRNA MALAT1調(diào)控,最后研究基因載體攜帶miRNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后的生物學(xué)影響,劃痕實(shí)驗(yàn)研究對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和增殖影響,計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響,單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)研究較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)腫瘤細(xì)胞單克隆增殖的影響,侵襲實(shí)驗(yàn)研究對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移影響。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)取得初步成功,特定的miRNA可利用合作實(shí)驗(yàn)室最新基因載體PER-PGEA和帶葉酸配體的基因載體PER-PGEA-FA絡(luò)合高效轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞,分別研究出質(zhì)粒DNA、miRNA與新基因載體的最優(yōu)絡(luò)合轉(zhuǎn)染氮磷比,同時(shí)兼顧低毒安全和高效轉(zhuǎn)染,特定的miRNA利用基因載體進(jìn)入食管癌細(xì)胞之后,能靶向調(diào)控促癌IncRNA MALAT 1,并能夠影響食管癌腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等。并且驗(yàn)證帶葉酸配體的基因載體PER-PGEA-FA效果要略優(yōu)于不帶葉酸配體的PER-PGEA。癌癥分子生物學(xué)研究結(jié)合新基因載體研發(fā)技術(shù)是一種潛力巨大的基因治療策略,擁有特異性高、安全性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),給人們的疾病治療帶來(lái)的巨大希望,具有較好的臨床應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：靶向 MALAT1 基因治療 食管癌
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1;R450
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-16
• 符號(hào)說(shuō)明16-17
• 第一章 緒論17-31
• 1.1 引言17-18
• 1.2 miRNA和lncRNA簡(jiǎn)介18-22
• 1.2.1 miRNA-10118-19
• 1.2.2 miR-21719-20
• 1.2.3 MALAT120
• 1.2.4 miRNA與lncRNA20-21
• 1.2.5 miRNA與食管癌關(guān)系21-22
• 1.3 基因治療22-23
• 1.3.1 抑癌基因治療22
• 1.3.2 基因沉默治療22-23
• 1.3.3 針對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)基因的治療23
• 1.4 陽(yáng)離子聚合物載體23-27
• 1.4.1 簡(jiǎn)介23-24
• 1.4.2 基因載體運(yùn)轉(zhuǎn)及影響因素24-25
• 1.4.3 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中的影響因素25-27
• 1.4.3.1 毒性影響25-26
• 1.4.3.2 體外實(shí)驗(yàn)中的影響因素26-27
• 1.4.3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的影響因素27
• 1.5 轉(zhuǎn)染27-28
• 1.6 研究的基礎(chǔ)28-29
• 1.7 立題背景與研究意義29-31
• 第二章 基因載體在食管癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染研究31-67
• 2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、材料和設(shè)備31-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料31-33
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系33
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液配制33-34
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-50
• 2.2.1 文獻(xiàn)查詢35-36
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.2.2.1 培養(yǎng)基的配置36
• 2.2.2.2 復(fù)蘇和凍存36
• 2.2.2.3 培養(yǎng)36-37
• 2.2.2.4 傳代37
• 2.2.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)與鋪板實(shí)驗(yàn)37
• 2.2.3 陽(yáng)離子聚合物基因載體性能研究實(shí)驗(yàn)37-50
• 2.3.3.1 基因載體準(zhǔn)備37-38
• 2.2.3.2 質(zhì)粒復(fù)合物溶液與miRNA復(fù)合溶液配置38-40
• 2.2.3.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)40
• 2.2.3.5 綠色熒光蛋白實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.2.3.6 粒徑與表面電荷實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.3.7 AFM實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.3.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)41-42
• 2.2.3.9 檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)42-47
• 2.2.3.10 轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)靶基因MALAT1影響47-50
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論50-64
• 2.3.1 熒光素酶實(shí)驗(yàn)50-52
• 2.3.2 綠色熒光蛋白(EGFP)實(shí)驗(yàn)52-53
• 2.3.3 粒徑和表面電位測(cè)定53-55
• 2.3.4 AFM原子力顯微鏡檢測(cè)55-56
• 2.3.5 毒性MTT實(shí)驗(yàn)56-58
• 2.3.6 檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)58-61
• 2.3.7 轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)靶l(wèi)ncRNA MALAT1影響61-64
• 2.4 小結(jié)64-67
• 第三章 基因載體在食管癌細(xì)胞生物學(xué)性能的研究67-81
• 3.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、材料和設(shè)備67-69
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)材料67
• 3.1.2 生物學(xué)性能檢測(cè)試劑67
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系67
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器67-69
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法69-71
• 3.2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)69
• 3.2.2 計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)69
• 3.2.3 單克隆形成實(shí)驗(yàn)69-70
• 3.2.4 侵襲實(shí)驗(yàn)70-71
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論71-79
• 3.3.1 劃痕實(shí)驗(yàn)71-75
• 3.3.2 計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)75-76
• 3.3.3 單克隆形成實(shí)驗(yàn)76-78
• 3.3.4 侵襲實(shí)驗(yàn)78-79
• 3.4 小結(jié)79-81
• 第四章 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)81-82
• 4.1 結(jié)論81
• 4.2 創(chuàng)新點(diǎn)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-86
• 致謝86-87
• 研究成果及已發(fā)表的論文87-88
• 作者和導(dǎo)師簡(jiǎn)介88-89
• 附件89-90

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1017752