本文關(guān)鍵詞：siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞Notch1基因沉默作用的研究

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【摘要】：目的本文利用基因干擾技術(shù)來抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞Notch1基因的表達(dá),在細(xì)胞水平上進(jìn)行Notch1基因敲除效率的評估。雖然基因干擾技術(shù)有著巨大的潛力,然而,siRNA易降解的特性限制其臨床應(yīng)用,并且siRNA遞送系統(tǒng)仍然存在著諸多缺陷,如轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性差等問題。所以,設(shè)計(jì)高效、穩(wěn)定、安全的Notch1 siRNA載藥系統(tǒng)對增強(qiáng)抗卵巢癌作用具有非常重要的意義。本文合成N-(N,N’-二甲基)丙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺(DMAPA-CHEMS)陽離子膽固醇材料,合用大豆卵磷脂S100制備陽離子脂質(zhì)體,并對其制劑學(xué)特征,在核酸酶和血清中的穩(wěn)定性,細(xì)胞毒性,細(xì)胞攝取效率,Notch1 mRNA沉默和Notch1蛋白下調(diào)效率,增殖和凋亡方面進(jìn)行了評價(jià),為構(gòu)建安全有效的siRNA載體系統(tǒng)提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。方法利用膽固醇、丁二酸酐、N,N-二甲基丙二胺(DMAPA)、DCC和NHS合成DMAPA-CHEMS,與大豆磷脂S100采用薄膜法制備陽離子脂質(zhì)體。利用動態(tài)激光散射儀(DLS)測DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體粒徑和電位,透射電鏡觀察形態(tài)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析脂質(zhì)體在0.1mg/mL RNase和25% FBS環(huán)境中對siRNA保護(hù)作用。采用 CCK-8試劑盒考察了DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體和N,C-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物細(xì)胞毒性,流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡考察了SKOV3對siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的攝取,利用熒光定量PCR和Western Blot評價(jià)了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對Notch1基因的沉默效率。最后采用CCK-8試劑盒考查了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞增殖的影響,細(xì)胞凋亡試劑盒測定Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的粒徑隨N/P比增加而減小。N/P=100時(shí),粒徑(100.94±3.72)nm,電位(46.54±4.32)mV。透射電鏡顯示其為圓形或類圓形。RNase和血清穩(wěn)定性試驗(yàn)中,可以看到載體可以顯著提高siRNA穩(wěn)定性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示隨N/P比增加,細(xì)胞攝取增加,N/P=100時(shí),攝取達(dá)到最大值。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示SKOV3細(xì)胞對siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物攝取效率高。熒光定量PCR結(jié)果表明N/P=100時(shí),對SKOV3細(xì)胞Notchl mRNA表達(dá)抑制最大,其2-△△Ct為0.34±0.04,明顯低于空白組0.944-0.07。Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS日離子脂質(zhì)體復(fù)合物24小時(shí)后即可見SKOV3細(xì)胞Notchl蛋白表達(dá)明顯下調(diào),轉(zhuǎn)染72 h后蛋白表達(dá)為(26.47±6.23)%,顯著低于對照組(100.00±11.02)%。CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可以看到DMAPA-CHEMS日離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性較小,濃度100μg/mL時(shí),轉(zhuǎn)染后24 h、48 h或72 h,細(xì)胞存活率都高于80%。結(jié)果表明,DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體作為基因運(yùn)送載體,本身并無明顯的細(xì)胞毒性,但是Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,N/P比100時(shí),轉(zhuǎn)染72 h后,細(xì)胞存活率下降到(60.45±2.24)%,與陰性對照(86.43±0.87)%有顯著差異。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞的凋亡有明顯促進(jìn)作用。結(jié)論本研究所制備的siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物具有較小的粒徑,表面帶正電荷,形態(tài)為圓形或類圓形。核酸酶和血清蛋白環(huán)境中具有良好的siRNA穩(wěn)定性,細(xì)胞毒性小,具有較高的細(xì)胞攝取率,較強(qiáng)的靶基因沉默和蛋白下調(diào)效率。
【關(guān)鍵詞】：基因載體 DMAPA-CHEMS 陽離子脂質(zhì)體 基因轉(zhuǎn)染 基因沉默
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 縮略詞11-14
• 第一章 緒論14-18
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 立題依據(jù)16-18
• 第二章 DMAPA-CHEMS脂質(zhì)體構(gòu)建和性質(zhì)考察18-27
• 2.1 儀器和材料18-19
• 2.1.1 主要儀器18
• 2.1.2 主要材料18-19
• 2.2 方法與操作19-21
• 2.2.1 DMAPA-CHEMS的制備19-20
• 2.2.2 DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體的制備20
• 2.2.3 脂質(zhì)體形態(tài)表征20-21
• 2.2.4 粒徑和Zeta電位測定21
• 2.2.5 RNase穩(wěn)定性和血清穩(wěn)定性試驗(yàn)21
• 2.3 結(jié)果和討論21-26
• 2.3.1 粒徑、Zeta電位和形態(tài)測定21-24
• 2.3.2 RNase穩(wěn)定性和FBS穩(wěn)定性試驗(yàn)24-26
• 2.4 本章小結(jié)26-27
• 第三章 SKOV3細(xì)胞對siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的攝取及體外評價(jià)27-56
• 3.1 儀器與材料27-29
• 3.1.1 主要儀器27-28
• 3.1.2 主要材料28-29
• 3.1.3 細(xì)胞株29
• 3.2 溶液的配制29-30
• 3.3 方法和操作30-42
• 3.3.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)30-32
• 3.3.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染32-33
• 3.3.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.3.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測Notchl mRNA的表達(dá)34-37
• 3.3.5 Western Blot檢測Notchl蛋白表達(dá)37-39
• 3.3.6 細(xì)胞毒性和增殖實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.3.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)40-42
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論42-55
• 3.4.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和Notchl siRNA序列的篩選42-44
• 3.4.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)44-47
• 3.4.3 Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對Notchl-mRNA表達(dá)的影47-48
• 3.4.4 Western Blot檢測Notchl蛋白表達(dá)48-49
• 3.4.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和增殖實(shí)驗(yàn)49-53
• 3.4.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)53-55
• 3.5 本章小結(jié)55-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 文獻(xiàn)綜述59-74
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 個(gè)人簡歷74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況74

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本文編號：1017189