本文關(guān)鍵詞：肺癌組織中EGFR 19、21外顯子基因突變豐度的熒光偏振檢測研究

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【摘要】：【背景】肺癌是全球男性死亡率最高的腫瘤,并且,在發(fā)達國家女性中,肺癌已超過乳腺癌,成為女性死亡的第一大腫瘤。人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向治療藥物(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是針對肺癌中EGFR及其信號通路的小分子阻斷劑,是一種化學(xué)合成的靶向治療藥物,在非小細胞肺癌特別是腺癌EGFR敏感突變者中療效顯著,已被批準(zhǔn)單藥治療作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性晚期非小細胞型肺癌的二、三線治療或一線治療。然而,近年來對EGFR-TKIs耐藥及療效差異性的報道屢見不鮮,此類藥物的敏感及耐藥相關(guān)因素也逐漸被發(fā)現(xiàn),并用于篩選更加適合的患者。但是,在臨床中盡管一些患者含有EGFR敏感突變,卻也對EGFR-TKIs的療效較差。我們基于這一現(xiàn)象提出假設(shè):腫瘤內(nèi)是否存在基因突變豐度的異質(zhì)性,并可能造成靶向治療的療效差異?熒光偏振技術(shù)(fluorescence polarization,FP)是一種高靈敏度的熒光標(biāo)記檢測方法,可檢測不同波長的熒光強度值,結(jié)合探針的靶向結(jié)合特性因而特別適用于基因突變的檢測。目前,大多數(shù)EGFR基因突變檢測技術(shù)未能檢測瘤內(nèi)基因突變豐度,因此不能全面評估瘤內(nèi)突變豐度的信息,為此我們基于熒光偏振技術(shù)在基因突變檢測方面的優(yōu)勢,初步設(shè)計并建立了一種檢測肺癌標(biāo)本中EGFR基因敏感突變豐度的檢測方法以便為臨床預(yù)測靶向藥物的療效以及制定合理的治療策略提供依據(jù)�！灸康摹拷⒁环N快速、靈敏、特異的基于熒光偏振技術(shù)的檢測體系和方法,并將該方法用于檢測肺癌標(biāo)本中EGFR 19、21外顯子的基因突變豐度,以期全面準(zhǔn)確地預(yù)測靶向藥物個體化使用。另外,對接受吉非替尼治療的患者進行隨訪,統(tǒng)計緩解率與生存期,進一步證明EGFR基因突變豐度對吉非替尼藥物療效與預(yù)后的預(yù)測價值。【方法】第一部分,建立熒光偏振檢測的標(biāo)準(zhǔn)體系。首先,提取含有EGFR 19、21外顯子突變型與EGFR 19、21外顯子野生型患者的全基因組DNA,設(shè)計引物,特異的熒光標(biāo)記探針。然后,分別構(gòu)建EGFR 19、21外顯子野生型與EGFR 19、21外顯子突變型的4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。最后,經(jīng)過熒光偏振PCR反應(yīng),得出擴增產(chǎn)物并使用熒光偏振儀檢測反應(yīng)液的偏振值(FP)。根據(jù)FP值與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)繪制曲線圖,進而根據(jù)曲線的線性趨勢得出直線方程。再經(jīng)過穩(wěn)定性,特異性,靈敏性的驗證后即作為后續(xù)實驗的定量標(biāo)準(zhǔn)。第二部分,將建立好的標(biāo)準(zhǔn)體系和方法應(yīng)用于臨床肺癌病理標(biāo)本中EGFR19、21外顯子基因突變豐度的檢測,并將患者的DNA經(jīng)普通PCR擴增EGFR19、21外顯子目的序列后,送測序,將兩種檢測方法的結(jié)果進行比較,驗證本法的準(zhǔn)確性。并對接受吉非替尼靶向治療的58例患者進行療效和生存期的隨訪,運用統(tǒng)計學(xué)方法分析其與EGFR19、21外顯子基因突變豐度大小的關(guān)系,再次對該檢測方法的實用價值及有效性進行驗證。【結(jié)果】本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)體系經(jīng)過全面驗證,具有穩(wěn)定性好,靈敏性高,特異性強的優(yōu)點。該方法最低檢測濃度為40拷貝/ul,最低可檢測的EGFR基因突變豐度大小為10%。該方法對標(biāo)本是否含有突變的檢測結(jié)果和直接測序法檢測結(jié)果相一致。將受試者的突變豐度與其接受吉非替尼的藥物療效以及生存期進行統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)基因突變豐度高者比低者對靶向藥物反應(yīng)性好,并且至疾病進展時間(TTP)與總生存期(OS)具有差異性,并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)�！窘Y(jié)論】熒光偏振(FP)檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合可用于基因突變及其突變豐度的檢測,并且有操作便捷、特異性強、靈敏度較高、可提供全面的瘤內(nèi)異質(zhì)性分析等優(yōu)勢。我們研究并建立了一種檢測非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中EGFR基因突變豐度的新方法,將為指導(dǎo)肺癌個體化治療提供良好的檢測技術(shù)平臺。
【關(guān)鍵詞】：熒光偏振檢測 肺癌 表皮生長因子受體 突變豐度
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-28
• 第一部分EGFR 19、21外顯子基因突變拷貝數(shù)熒光偏振檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的建立28-45
• 1 實驗材料28-31
• 1.1 主要實驗儀器28-29
• 1.2 主要購買試劑29
• 1.3 主要配制試劑29-31
• 2 實驗步驟31-38
• 2.1 設(shè)計引物與探針31
• 2.2 EGFR 19、21外顯子野生型與突變型標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建31-36
• 2.3 熒光偏振檢測PCR反應(yīng)體系的初步建立36-37
• 2.4 熒光偏振檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的建立與優(yōu)化37
• 2.5 驗證熒光偏振檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的敏感性37
• 2.6 驗證熒光偏振檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的穩(wěn)定性37-38
• 2.7 驗證熒光偏振檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的特異性38
• 2.8 統(tǒng)計分析檢測結(jié)果38
• 3 結(jié)果38-43
• 3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的驗證38-39
• 3.2 瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物的變化趨勢39-40
• 3.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化40-41
• 3.4 熒光偏振值與模板拷貝數(shù)關(guān)系的曲線趨勢圖41-42
• 3.5 熒光偏振檢測反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的靈敏度分析42
• 3.6 熒光偏振檢測反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的穩(wěn)定性分析42
• 3.7 熒光偏振檢測反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的特異性分析42-43
• 4 討論43-45
• 第二部分 非小細胞肺癌臨床標(biāo)本中EGFR基因突變豐度的檢測45-57
• 1 實驗材料45-47
• 1.1 實驗儀器及設(shè)備45-46
• 1.2 購買試劑46
• 1.3 配制試劑46-47
• 2 實驗方法47-50
• 2.1 收集患者標(biāo)本與資料47
• 2.2 設(shè)計引物與探針47-48
• 2.3 標(biāo)本DNA提取48
• 2.4 標(biāo)本熒光偏振PCR與基因突變豐度的檢測48-49
• 2.5 直接測序法驗證標(biāo)本EGFR基因突變49
• 2.6 統(tǒng)計分析隨訪資料49-50
• 3 結(jié)果50-55
• 3.1 整理患者臨床資料50
• 3.2 PCR產(chǎn)物片段大小驗證50-51
• 3.3 標(biāo)本熒光偏振PCR與基因突變豐度的檢測51
• 3.4 直接測序結(jié)果與熒光偏振檢測結(jié)果的比較51-53
• 3.5 療效與生存分析53-55
• 4 討論55-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻58-65
• 個人簡歷和研究成果65-66
• 致謝66

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本文編號：1015569