本文關(guān)鍵詞：肺癌組織中EGFR 19、21外顯子基因突變豐度的熒光偏振檢測(cè)研究

  更多相關(guān)文章： 熒光偏振檢測(cè) 肺癌 表皮生長(zhǎng)因子受體 突變豐度

【摘要】：【背景】肺癌是全球男性死亡率最高的腫瘤,并且,在發(fā)達(dá)國(guó)家女性中,肺癌已超過乳腺癌,成為女性死亡的第一大腫瘤。人表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向治療藥物(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是針對(duì)肺癌中EGFR及其信號(hào)通路的小分子阻斷劑,是一種化學(xué)合成的靶向治療藥物,在非小細(xì)胞肺癌特別是腺癌EGFR敏感突變者中療效顯著,已被批準(zhǔn)單藥治療作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性晚期非小細(xì)胞型肺癌的二、三線治療或一線治療。然而,近年來(lái)對(duì)EGFR-TKIs耐藥及療效差異性的報(bào)道屢見不鮮,此類藥物的敏感及耐藥相關(guān)因素也逐漸被發(fā)現(xiàn),并用于篩選更加適合的患者。但是,在臨床中盡管一些患者含有EGFR敏感突變,卻也對(duì)EGFR-TKIs的療效較差。我們基于這一現(xiàn)象提出假設(shè):腫瘤內(nèi)是否存在基因突變豐度的異質(zhì)性,并可能造成靶向治療的療效差異?熒光偏振技術(shù)(fluorescence polarization,FP)是一種高靈敏度的熒光標(biāo)記檢測(cè)方法,可檢測(cè)不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度值,結(jié)合探針的靶向結(jié)合特性因而特別適用于基因突變的檢測(cè)。目前,大多數(shù)EGFR基因突變檢測(cè)技術(shù)未能檢測(cè)瘤內(nèi)基因突變豐度,因此不能全面評(píng)估瘤內(nèi)突變豐度的信息,為此我們基于熒光偏振技術(shù)在基因突變檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì),初步設(shè)計(jì)并建立了一種檢測(cè)肺癌標(biāo)本中EGFR基因敏感突變豐度的檢測(cè)方法以便為臨床預(yù)測(cè)靶向藥物的療效以及制定合理的治療策略提供依據(jù)。【目的】建立一種快速、靈敏、特異的基于熒光偏振技術(shù)的檢測(cè)體系和方法,并將該方法用于檢測(cè)肺癌標(biāo)本中EGFR 19、21外顯子的基因突變豐度,以期全面準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)靶向藥物個(gè)體化使用。另外,對(duì)接受吉非替尼治療的患者進(jìn)行隨訪,統(tǒng)計(jì)緩解率與生存期,進(jìn)一步證明EGFR基因突變豐度對(duì)吉非替尼藥物療效與預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值�！痉椒ā康谝徊糠�,建立熒光偏振檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)體系。首先,提取含有EGFR 19、21外顯子突變型與EGFR 19、21外顯子野生型患者的全基因組DNA,設(shè)計(jì)引物,特異的熒光標(biāo)記探針。然后,分別構(gòu)建EGFR 19、21外顯子野生型與EGFR 19、21外顯子突變型的4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。最后,經(jīng)過熒光偏振PCR反應(yīng),得出擴(kuò)增產(chǎn)物并使用熒光偏振儀檢測(cè)反應(yīng)液的偏振值(FP)。根據(jù)FP值與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)繪制曲線圖,進(jìn)而根據(jù)曲線的線性趨勢(shì)得出直線方程。再經(jīng)過穩(wěn)定性,特異性,靈敏性的驗(yàn)證后即作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的定量標(biāo)準(zhǔn)。第二部分,將建立好的標(biāo)準(zhǔn)體系和方法應(yīng)用于臨床肺癌病理標(biāo)本中EGFR19、21外顯子基因突變豐度的檢測(cè),并將患者的DNA經(jīng)普通PCR擴(kuò)增EGFR19、21外顯子目的序列后,送測(cè)序,將兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行比較,驗(yàn)證本法的準(zhǔn)確性。并對(duì)接受吉非替尼靶向治療的58例患者進(jìn)行療效和生存期的隨訪,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其與EGFR19、21外顯子基因突變豐度大小的關(guān)系,再次對(duì)該檢測(cè)方法的實(shí)用價(jià)值及有效性進(jìn)行驗(yàn)證�！窘Y(jié)果】本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)體系經(jīng)過全面驗(yàn)證,具有穩(wěn)定性好,靈敏性高,特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。該方法最低檢測(cè)濃度為40拷貝/ul,最低可檢測(cè)的EGFR基因突變豐度大小為10%。該方法對(duì)標(biāo)本是否含有突變的檢測(cè)結(jié)果和直接測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果相一致。將受試者的突變豐度與其接受吉非替尼的藥物療效以及生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)基因突變豐度高者比低者對(duì)靶向藥物反應(yīng)性好,并且至疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)與總生存期(OS)具有差異性,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)�！窘Y(jié)論】熒光偏振(FP)檢測(cè)技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合可用于基因突變及其突變豐度的檢測(cè),并且有操作便捷、特異性強(qiáng)、靈敏度較高、可提供全面的瘤內(nèi)異質(zhì)性分析等優(yōu)勢(shì)。我們研究并建立了一種檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中EGFR基因突變豐度的新方法,將為指導(dǎo)肺癌個(gè)體化治療提供良好的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：熒光偏振檢測(cè) 肺癌 表皮生長(zhǎng)因子受體 突變豐度
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-28
• 第一部分EGFR 19、21外顯子基因突變拷貝數(shù)熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的建立28-45
• 1 實(shí)驗(yàn)材料28-31
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 1.2 主要購(gòu)買試劑29
• 1.3 主要配制試劑29-31
• 2 實(shí)驗(yàn)步驟31-38
• 2.1 設(shè)計(jì)引物與探針31
• 2.2 EGFR 19、21外顯子野生型與突變型標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建31-36
• 2.3 熒光偏振檢測(cè)PCR反應(yīng)體系的初步建立36-37
• 2.4 熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的建立與優(yōu)化37
• 2.5 驗(yàn)證熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的敏感性37
• 2.6 驗(yàn)證熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的穩(wěn)定性37-38
• 2.7 驗(yàn)證熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系的特異性38
• 2.8 統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)結(jié)果38
• 3 結(jié)果38-43
• 3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的驗(yàn)證38-39
• 3.2 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的變化趨勢(shì)39-40
• 3.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化40-41
• 3.4 熒光偏振值與模板拷貝數(shù)關(guān)系的曲線趨勢(shì)圖41-42
• 3.5 熒光偏振檢測(cè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的靈敏度分析42
• 3.6 熒光偏振檢測(cè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的穩(wěn)定性分析42
• 3.7 熒光偏振檢測(cè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系的特異性分析42-43
• 4 討論43-45
• 第二部分 非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本中EGFR基因突變豐度的檢測(cè)45-57
• 1 實(shí)驗(yàn)材料45-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備45-46
• 1.2 購(gòu)買試劑46
• 1.3 配制試劑46-47
• 2 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 2.1 收集患者標(biāo)本與資料47
• 2.2 設(shè)計(jì)引物與探針47-48
• 2.3 標(biāo)本DNA提取48
• 2.4 標(biāo)本熒光偏振PCR與基因突變豐度的檢測(cè)48-49
• 2.5 直接測(cè)序法驗(yàn)證標(biāo)本EGFR基因突變49
• 2.6 統(tǒng)計(jì)分析隨訪資料49-50
• 3 結(jié)果50-55
• 3.1 整理患者臨床資料50
• 3.2 PCR產(chǎn)物片段大小驗(yàn)證50-51
• 3.3 標(biāo)本熒光偏振PCR與基因突變豐度的檢測(cè)51
• 3.4 直接測(cè)序結(jié)果與熒光偏振檢測(cè)結(jié)果的比較51-53
• 3.5 療效與生存分析53-55
• 4 討論55-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果65-66
• 致謝66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;熒光偏振法──細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種新工具[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);1997年02期

2 董志偉;;熒光偏振技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1978年01期

3 豐美福;吳政安;劉樹森;董志偉;王杰;萬(wàn)文徽;;淋巴細(xì)胞的分離及其熒光偏振檢測(cè)[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1980年03期

4 王志彬;張學(xué)晶;王愈聰;高金鵬;李正平;;基于熒光偏振的高靈敏度蛋白激酶活性分析[J];化學(xué)學(xué)報(bào);2013年12期

5 彭長(zhǎng)德;劉瑩;蘭秀風(fēng);陸建;倪曉武;;血液靜態(tài)熒光偏振光譜研究[J];光學(xué)學(xué)報(bào);2006年10期

6 劉秀德;隋義壯;李廣文;;熒光偏振技術(shù)在男性不育癥研究中的應(yīng)用[J];山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1990年02期

7 孫■,岳海濤,楊世杰,陳光榮,徐洋;熒光偏振法測(cè)定紅細(xì)胞膜脂流動(dòng)性[J];白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1993年02期

8 趙晨;張亮;倪原;;熒光偏振技術(shù)在生命科學(xué)中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年16期

9 牛冬云;連煒;鄔智剛;郝曉峰;柯瀟;;熒光偏振法測(cè)定融合蛋白制劑中聚山梨醇酯20的含量[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年05期

10 曾偉成,楊輝,蔡欽榕,羅友華,黃亦琦;虎杖鞣質(zhì)的熒光偏振分析[J];海峽藥學(xué);2002年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李佳涵;章悅;李冉;張星河;趙光遠(yuǎn);劉義;;熒光偏振技術(shù)測(cè)定藥物對(duì)線粒體膜的流動(dòng)性的影響[A];第一屆全國(guó)生物物理化學(xué)會(huì)議暨生物物理化學(xué)發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

2 胡善明;趙顯峰;蔭士安;孟晶;徐青梅;;熒光偏振法測(cè)定腦神經(jīng)細(xì)胞膜脂流動(dòng)性[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];1996年

3 許晉;齊玉梅;王廣義;張明;楊輝;;熒光偏振法測(cè)定家兔血小板膜脂流動(dòng)性的研究[A];第11屆中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)全國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文（摘要）匯編[C];2007年

4 劉小蓉;章悅;李冉;劉義;;熒光偏振法測(cè)定線粒體膜的流動(dòng)性[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

5 黃勇;金雪;趙書林;;基于納米材料和核酸信號(hào)放大的高靈敏熒光偏振分析[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十七屆全國(guó)有機(jī)分析與生物分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

6 馬輝;;熒光偏振成像及其應(yīng)用[A];中國(guó)光學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

7 馬曉翠;邱陽(yáng);黃力新;林克椿;聶松青;;紅外光譜、熒光偏振研究海藻糖對(duì)POPE脂質(zhì)體Lα→H_Ⅱ相變的影響[A];第三屆全國(guó)現(xiàn)代生物物理技術(shù)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2000年

8 許耘川;袁向亮;沈立松;;HPLC法測(cè)定血清甲氨蝶呤濃度的方法建立及其與熒光偏振法的比較[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)成立30周年慶典大會(huì)資料匯編[C];2009年

9 殷明;王近中;辛佩珠;薛建華;趙可明;項(xiàng)光強(qiáng);;乙醇對(duì)大鼠紅細(xì)胞膜熒光偏振的影響[A];第二屆全國(guó)人—機(jī)—環(huán)境系統(tǒng)工程學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];1995年

10 焦凱;江華;張菊;王香玲;;模板指導(dǎo)的末端延伸反應(yīng)與熒光偏振檢測(cè)方法在eNOS基因單核苷酸多態(tài)性研究的應(yīng)用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)2004年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 記者 劉云濤;我國(guó)首次利用熒光偏振技術(shù)篩選新藥[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 楊陽(yáng);肺癌組織中EGFR 19、21外顯子基因突變豐度的熒光偏振檢測(cè)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 姜英浩;宮頸癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因啟動(dòng)子甲基化的熒光偏振檢測(cè)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

3 申銅飛;基于DNA探針的熒光檢測(cè)技術(shù)研究[D];聊城大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1015569