本文關(guān)鍵詞：沉默TIGAR增加β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制研究

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【摘要】：目的:研究β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)蛋白表達(dá)的影響,并研究TIGAR在β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞抗腫瘤治療中的作用,進(jìn)一步探討TIGAR影響β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用的相關(guān)機(jī)制。方法:通過Western Blot法,研究β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞HCT116 TIGAR蛋白表達(dá)的影響;采用小干擾RNA技術(shù)沉默腸癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)后通過CCK-8及克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測沉默TIGAR表達(dá)結(jié)合β-七葉皂苷鈉治療對腸癌細(xì)胞HCT116生存總體情況的影響;Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測β-七葉皂苷鈉治療聯(lián)合沉默TIGAR對腸癌細(xì)胞HCT116凋亡的影響情況,并用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白如PARP、Bcl-2、Bax、Caspase-3;2’,7’-二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH2-DA)標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、二氫乙啶(Dihydroethidium,DHE)探針標(biāo)記細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;彗星實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞DNA損傷情況;Western Blot檢測經(jīng)過相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理后HCT116細(xì)胞的DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX,和DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白,如p-ATM、Cdk5的表達(dá)。結(jié)果:研究β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞HCT116TIGAR表達(dá)的影響,我們使用不同濃度的β-七葉皂苷鈉作用于腸癌HCT116細(xì)胞,結(jié)果顯示:較低濃度的β-七葉皂苷鈉可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞TIGAR表達(dá)上調(diào),濃度40μg/ml時最高,之后表達(dá)下降;下一步研究β-七葉皂苷鈉作用于腸癌HCT116細(xì)胞不同時間后TIGAR的變化情況,結(jié)果顯示:較短時間內(nèi)的β-七葉皂苷鈉可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞TIGAR表達(dá)上調(diào),但是經(jīng)過較長時間β-七葉皂苷鈉作用后,我們觀察到TIGAR表達(dá)會有下調(diào)的表現(xiàn)。為了探討β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的TIGAR高表達(dá)對腸癌細(xì)胞HCT116抗腫瘤治療中的作用,我們首先利用TIGAR siRNA沉默腸癌細(xì)胞HCT116 TIGAR表達(dá),然后通過CCK8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測其處理的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默TIGAR表達(dá)聯(lián)合β-七葉皂苷鈉作用后,腸癌HCT116細(xì)胞的存活率出現(xiàn)顯著下降,并且細(xì)胞凋亡顯著增加。腫瘤的治療與多種機(jī)制相關(guān),其中ROS適應(yīng)性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞DNA損傷修復(fù)在腫瘤治療的形成中起著重要作用,TIGAR位于p53的下游基因,能抑制細(xì)胞糖酵解過程,而增加磷酸戊糖通路(PPP)產(chǎn)生的NADPH從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,接著降低了ROS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和ROS誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)。所以,為了進(jìn)一步探討β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制,我們分別從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞DNA損傷修復(fù)兩個方面來進(jìn)行研究。首先,沉默TIGAR表達(dá)顯著增加β-七葉皂苷鈉所誘導(dǎo)的腸癌細(xì)胞HCT116的凋亡,這些結(jié)果與ROS水平增加、Caspase-3激活等相關(guān)。以上結(jié)果顯示,沉默TIGAR表達(dá)增加β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞的治療效果與沉默TIGAR表達(dá)增加細(xì)胞凋亡有關(guān)。其次,沉默TIGAR表達(dá)亦可顯著增加β-七葉皂苷鈉所導(dǎo)致的腸癌細(xì)胞DNA損傷,當(dāng)我們給予PPP通路產(chǎn)物NADPH時,我們發(fā)現(xiàn)可部分減輕DNA損傷情況。提示:沉默TIGAR表達(dá)除了通過抑制PPP通路增加β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞DNA損傷外,還有其他機(jī)制的存在。隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TIGAR是通過調(diào)節(jié)Cdk5-ATM信號通路,參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的過程。綜上所述,TIGAR通過兩條途徑(即PPP途徑和Cdk5-AMT信號通路)調(diào)控β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù),影響β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞抗腫瘤治療效果。結(jié)論:β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞HCT116 TIGAR的表達(dá);沉默TIGAR表達(dá)增加β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞的抗腫瘤敏感性,其機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù)。TIGAR表達(dá)在β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞的抗腫瘤治療中的作用提示TIGAR成為抗腫瘤治療作用靶點(diǎn)的可能,也為臨床抗腫瘤治療尤其是β-七葉皂苷鈉對腸癌的抗腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)及依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：β-七葉皂苷鈉 TIGAR 凋亡 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.3
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 研究背景9-12
• 第一部分 沉默TIGAR通過調(diào)控細(xì)胞凋亡增加 β-七葉皂苷鈉的抗腫瘤作用12-25
• 第一節(jié) β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞TIGAR表達(dá)12-17
• 第二節(jié) 沉默TIGAR表達(dá)增加 β-七葉皂苷鈉對腸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用17-25
• 第二部分 沉默TIGAR通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)增加 β-七葉皂苷鈉的抗腫瘤作用25-33
• 第一節(jié) 沉默TIGAR表達(dá)增加 β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的腸癌細(xì)胞DNA損傷25-29
• 第二節(jié) 沉默TIGAR增加 β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的腸癌細(xì)胞DNA損傷的機(jī)制研究29-33
• 討論33-37
• 全文結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述41-51
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 英文縮寫詞表51-52
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文52-53
• 致謝53-54

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本文編號：1010469