發(fā)布時間：2017-10-10 14:00

  本文關(guān)鍵詞：Elongator對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Elp3 Elp4 遷移 侵襲

【摘要】：目的:通過研究Elp3過表達(dá)和Elp3干擾表達(dá)的HepG2細(xì)胞株以及Elp4過表達(dá)和Elp4干擾表達(dá)的HepG2細(xì)胞株的遷移侵襲能力的改變,探討Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。方法:1.鑒定Elp3干擾質(zhì)粒GV248-Elp3i和Elp4干擾質(zhì)粒GV248-Elp4i,以及Elp3過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp3o和Elp4過表達(dá)質(zhì)粒p FLAG-CMV4-Elp4o。2.確定肝癌細(xì)胞HepG2的Puror和G418藥物篩選濃度。3.轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后的Hep G2細(xì)胞經(jīng)Puror篩選得到Elp3穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和Elp4穩(wěn)定干擾細(xì)胞株;轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后的HepG2細(xì)胞經(jīng)G418篩選得到Elp3過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株和Elp4過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。4.通過RT-PCR、Real-time PCR和Western blot鑒定各組細(xì)胞株中外源質(zhì)粒的整合,檢測Elp3和Elp4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。5.劃痕實驗,Transwell侵襲遷移實驗檢測各細(xì)胞株遷移和侵襲能力的改變。6.Real-time PCR檢測各細(xì)胞株中MMP-2、MMP-9和Paxillin的mRNA表達(dá)水平。7.Western blot檢測各細(xì)胞株中PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9和Paxillin的蛋白表達(dá)水平。8.Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量Elp3過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp3o、Elp4過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp4o、Elp3干擾質(zhì)粒GV248-Elp3i和Elp4干擾質(zhì)粒GV248-Elp4i的細(xì)胞株中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)水平。9.通過Western blot檢測PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)水平確定肝癌細(xì)胞HepG2的PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002的濃度。10.劃痕實驗,Transwell侵襲遷移實驗檢測抑制劑LY294002處理后的各細(xì)胞株遷移和侵襲能力的改變。11.real-timepcr檢測抑制劑ly294002處理后的各細(xì)胞株中mmp-2和mmp-9的mrna表達(dá)水平。12.westernblot檢測抑制劑ly294002處理后的各細(xì)胞株中pi3k、akt、p-akt、mmp-2和mmp-9的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,成功檢測到elp3過表達(dá)質(zhì)粒:pflag-cmv4-elp3o中1601bp的重組elp3條帶;elp4過表達(dá)質(zhì)粒:pflag-cmv4-elp4o中1613bp的重組elp4條帶;elp3干擾質(zhì)粒:gv248-elp3i中44bp的shrna條帶;elp4干擾質(zhì)粒:gv248-elp4i中44bp的shrna條帶。2.hepg2細(xì)胞于含不同濃度g418或puror的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后,得出50ng/μl為puror藥物篩選濃度,600ng/μl為g418藥物篩選濃度。3.hepg2細(xì)胞轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒24h后,加入g418或puror篩選14天,經(jīng)單克隆挑取和單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)及鑒定,得到目標(biāo)細(xì)胞株。4.劃痕實驗和transwell實驗證明了elp3和elp4過表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,干擾elp3和elp4則抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.real-timepcr檢測發(fā)現(xiàn)elp3和elp4過表達(dá)能增加肝癌細(xì)胞中的mmp-2、mmp-9和paxillin的mrna表達(dá)水平,干擾elp3和elp4則抑制肝癌細(xì)胞中的mmp-2、mmp-9和paxillin的mrna表達(dá)水平6.westernblot檢測各細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)elp3和elp4過表達(dá)能增加肝癌細(xì)胞中p-akt、mmp-2、mmp-9和paxillin的蛋白表達(dá)水平,干擾elp3和elp4則抑制肝癌細(xì)胞中的p-akt、mmp-2、mmp-9和paxillin的蛋白表達(dá)水平。7.westernblot檢測瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量elp3過表達(dá)質(zhì)粒pflag-cmv4-elp3o、elp4過表達(dá)質(zhì)粒pflag-cmv4-elp4o、elp3干擾質(zhì)粒gv248-elp3i和elp4干擾質(zhì)粒gv248-elp4i的細(xì)胞株中pi3k、akt和p-akt的蛋白表達(dá)水平,得出elp3和elp4的表達(dá)量與akt磷酸化水平兩者間存在劑量效應(yīng)。8.劃痕實驗,transwell侵襲遷移實驗檢測,加入抑制劑ly294002處理后,能抑制各細(xì)胞株遷移和侵襲能力。9.Real-time PCR檢測抑制劑LY294002處理后,HepG2細(xì)胞株、Elp3過表達(dá)細(xì)胞株和Elp4過表達(dá)細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平降低,Elp3干擾細(xì)胞株和Elp4干擾細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。10.Western blot檢測抑制劑LY294002處理后的各細(xì)胞株中p-AKT、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平均降低。結(jié)論:1.Elp3和Elp4過表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而干擾Elp3和Elp4表達(dá)可以抑制這一現(xiàn)象。2.Elp3和Elp4可以通過PI3K/AKT途徑來調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
【關(guān)鍵詞】：Elp3 Elp4 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 穩(wěn)定干擾ELP3和ELP4細(xì)胞株的構(gòu)建15-38
• 1 材料與方法15-28
• 1.1 材料15-16
• 1.2 主要儀器設(shè)備16-17
• 1.3 實驗方法17-28
• 2 實驗結(jié)果28-35
• 2.1 Elp3和Elp4干擾載體的構(gòu)建以及最佳靶位點的篩選28-30
• 2.2 Elp3干擾質(zhì)粒和Elp4干擾質(zhì)粒的鑒定30-31
• 2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選31-33
• 2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定33-35
• 3 討論35-38
• 第二部分 ELP3和ELP4對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其分子機(jī)制的研究38-77
• 1 材料與方法38-50
• 1.1 材料38-39
• 1.2 主要儀器設(shè)備39-40
• 1.3 實驗方法40-50
• 2 實驗結(jié)果50-73
• 2.1 劃痕實驗測定Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移的影響50-53
• 2.2 Transwell實驗檢測Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響53-55
• 2.3 檢測Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)量的影響55-57
• 2.4 Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT途徑的影響57-58
• 2.5 Elp3和Elp4對AKT磷酸化的劑量效應(yīng)58-62
• 2.6 抑制劑LY294002對AKT磷酸化的劑量效應(yīng)62-63
• 2.7 LY294002抑制Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用63-65
• 2.8 LY294002抑制Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用65-67
• 2.9 檢測LY294002對肝癌細(xì)胞內(nèi)Elp3、Elp4以及MMPs表達(dá)量的影響67-70
• 2.10 LY294002抑制Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT途徑的影響70-72
• 2.11 Elp3 和 Elp4 對肝癌細(xì)胞內(nèi) FAK/Paxillin 途徑的影響72-73
• 3 討論73-77
• 結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 綜述：腫瘤轉(zhuǎn)移與AKT激活作用85-100
• 參考文獻(xiàn)93-100
• 展望100-101
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文101-102
• 本文受以下基金資助102-103
• 縮略詞表103-104
• 致謝104-105

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本文編號：1006738