發(fā)布時間：2017-10-09 16:03

  本文關(guān)鍵詞：G四鏈體抑制結(jié)腸癌細胞增殖和血管生成的研究

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【摘要】：目的:本實驗設(shè)計合成PU22片段,體外研究其對VEGF基因表達、結(jié)腸癌細胞生長及血管生成的影響作用。方法:(1)利用生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計針對VEGF啟動子的PU22序列,另外將PU22序列打亂設(shè)計對照序列MUTPU22,并通過基因庫比對確保其特異性。(2)將帶有FITC熒光標記的寡核苷酸鏈PU22加入結(jié)腸癌HCT116細胞和SW480細胞中,分析結(jié)腸癌細胞攝取寡核苷酸鏈PU22的情況。(3)提取用MUTPU22或不同濃度PU22處理的HCT116細胞和SW480細胞的總RNA,采用q RT-PCR技術(shù)檢測VEGF基因m RNA表達水平,進而找出最佳作用濃度。(4)后續(xù)實驗分為3組:PU22處理的實驗組、MUTPU22處理的對照組和未處理的空白組。(5)提取結(jié)腸癌細胞總蛋白,通過Western blotting實驗測得各組VEGF蛋白表達水平。(6)采用Annexin V-FITC法通過流式細胞儀檢測PU22對細胞凋亡的影響;利用MTT實驗觀察各組結(jié)腸癌細胞的增殖變化。(7)利用HUVEC進行體外小管形成實驗,檢測PU22對血管形成的影響。結(jié)果:(1)利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫成功篩選設(shè)計出可能作用于VEGF啟動子區(qū)域的PU22序列(5'-CGGGGCGGGCCGGGGGCGGGGT-3')和對照序列MUTPU22(5'-CGAGTCGCGCCGAGTGCGAGAT-3')。通過基因庫比對序列具有較高的特異性。(2)利用細胞攝取實驗檢測PU22已成功的被結(jié)腸癌細胞攝取,且攝取率高達90%。(3)熒光實時定量PCR實驗結(jié)果顯示人結(jié)腸癌細胞HCT116和SW480經(jīng)不同濃度PU22作用后,細胞中VEGF基因RNA的表達量皆有降低,其中濃度為8μM時作用最明顯,最佳作用時間為48小時,SW480細胞作用效果優(yōu)于HCT116細胞,其中8μMPU22作用SW480細胞48小時后,VEGF基因m RNA表達量為0.027±0.002。結(jié)果表明PU22序列可以抑制VEGF基因m RNA的表達。(4)Western blotting檢測結(jié)果顯示經(jīng)過不同條件處理HCT116細胞48h后,實驗組灰度值(0.074±0.007)明顯皆小于空白組(0.737±0.034)和對照組(0.513±0.013),且皆有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);72h后實驗組灰度值(0.252±0.094)略小于空白組(0.466±0.063)和對照組(0.396±0.119);經(jīng)過不同條件處理SW480細胞48h后實驗組灰度值(0.029±0.001)皆明顯小于空白組(0.572±0.127)和對照組(0.488±0.034),且都有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),72h后實驗組灰度值(0.113±0.009)皆明顯小于空白組(0.635±0.061)和對照組(0.481±0.007),且都有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果表明人結(jié)腸癌HCT116和SW480細胞經(jīng)不同條件作用后,細胞中VEGF蛋白的表達量皆有降低,說明設(shè)計的外源G四鏈體PU22可以抑制VEGF基因蛋白的表達。(5)Annexin V-FITC法檢測各組細胞48h后的凋亡情況。結(jié)腸癌HCT116細胞實驗組的凋亡率(42.46%±2.03%)高于對照組(28.78%±1.87%),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。SW480細胞實驗組的凋亡率(69.14%±1.77%)大于對照組(32.95%±2.18%),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果表明PU22可以誘導(dǎo)HCT116與SW480細胞凋亡。(6)MTT實驗結(jié)果顯示:從72h起,實驗組結(jié)腸癌細胞的增值水平顯著低于空白組跟對照組,此時SW480細胞實驗組、對照組、空白組的OD450分別為0.247±0.067、0.408±0.034、0.423±0.115;HCT116細胞實驗組、對照組、空白組的OD450分別為0.402±0.193、0.896±0.074、0.921±0.127。說明外源G四鏈體PU22可以抑制結(jié)腸癌HCT116和SW480細胞的增殖能力。(7)小管形成實驗結(jié)果顯示:PU22作用結(jié)腸癌細胞后,HCT116細胞實驗組、對照組、空白組血管的形成數(shù)分別為11.5±1.81、24.5±0.97、26±2.62;SW480細胞實驗組、對照組、空白組血管的形成數(shù)分別為8.27±2.04、21.3±1.66、21.5±0.91。實驗組的血管生成率明顯小于對照組和空白組,且管腔不完整,說明PU22可以抑制體外血管生成。結(jié)論:結(jié)腸癌細胞HCT116和SW480成功攝取寡核苷酸PU22序列后可以抑制VEGF基因的表達,誘導(dǎo)細胞凋亡,抑制細胞增殖。其細胞分泌物也可抑制HUVEC體外血管生成能力。其作用機制可能與基因啟動子區(qū)域G四鏈體的形成有關(guān),本研究為結(jié)腸癌的治療提供新的思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：VEGF G四鏈體 PU22 血管生成
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用縮寫詞中英文對照表11-12
• 前言12-15
• 1 材料與方法15-31
• 1.1 實驗材料15-20
• 1.2 實驗方法20-31
• 2 結(jié)果31-41
• 2.1 結(jié)腸癌細胞攝取PU22 情況31
• 2.2 PU22 下調(diào)結(jié)腸癌細胞VEGF基因RNA表達31-33
• 2.3 PU22 下調(diào)結(jié)腸癌細胞VEGF蛋白表達33-35
• 2.4 PU22 誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡35-36
• 2.5 PU22 結(jié)腸癌細胞增殖能力36-38
• 2.6 PU22 抑制HUVEC體外血管生成38-41
• 3 討論41-44
• 4 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-48
• 綜述48-60
• 參考文獻57-60
• 致謝60-61
• 在學(xué)期間承擔/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個人簡介62

【參考文獻】

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本文編號：1001097