【摘要】：推拿手法作為傳統(tǒng)中醫(yī)外治療法,其本質(zhì)為機械力學(xué)刺激,能產(chǎn)生如壓力、張力、摩擦力和剪應(yīng)力等多種形式的“推拿力”(機械力),在機械力作用下人體組織細(xì)胞對機械刺激的反應(yīng)可能是推拿細(xì)胞生物力學(xué)原理之一,如何將力學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N生化信號是推拿手法機制研究的關(guān)鍵。目前,對手法生物力學(xué)原理的研究已由宏觀向微觀深入,但體內(nèi)復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境因素使體內(nèi)研究難以區(qū)別單一效應(yīng)或特定的聯(lián)合效應(yīng),基于細(xì)胞分析的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)給這一難題的解決帶來轉(zhuǎn)機;機體內(nèi)的各種力學(xué)敏感細(xì)胞是手法機械力作用的主要部位和效應(yīng)靶點;通過文獻檢索我們發(fā)現(xiàn),目前,已有研究者構(gòu)建了一些推拿手法相關(guān)的骨骼肌細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型,發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)(頻率、時間、力)作用下組織細(xì)胞的部分力學(xué)響應(yīng)特征,但他們之間的關(guān)系未能得到很好的闡述;我們前期工作發(fā)現(xiàn)相同手法的不同生物力學(xué)參數(shù)及其所引發(fā)的力學(xué)效應(yīng)存在差異,但是因為何種因素導(dǎo)致這種不同生物力學(xué)參數(shù)機械力刺激下力學(xué)效應(yīng)的差異?不同生物力學(xué)參數(shù)機械力刺激下細(xì)胞的生物力學(xué)效應(yīng)有何異同?我們?nèi)匀徽J(rèn)識較淺。目的:構(gòu)建骨骼肌細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型,模擬推拿機械力刺激,觀察恒定壓力作用下不同刺激時間以及固定時間不同應(yīng)力模式、不同強度刺激下大鼠骨骼肌細(xì)胞(RSkMCs)生物學(xué)力響應(yīng)特征,探討推拿手法效應(yīng)機制。方法:體外培養(yǎng)RSkMCs,采用四點彎曲細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)(FPBS)施加類推拿機械力刺激,觀察恒定壓力作用下不同時間;及固定時間,不同應(yīng)力模式、不同強度機械力作用下RSkMCs生物力學(xué)效應(yīng)的變化,采用倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及排列變化,流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞周期、凋亡及細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度變化,計算細(xì)胞S期細(xì)胞比例(SPF)及增殖指數(shù)(PI)的變化;免疫組織化學(xué)(IHC)檢測MyOD、Myf5蛋白表達(dá)水平的變化;酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELIS A)和硝酸還原酶法(NRM)分別檢測培養(yǎng)上清液中白介素6(IL-6)、前列腺素E_2(PGE_2)和一氧化氮(NO)濃度的變化;分析各指標(biāo)之間相關(guān)性。結(jié)果:1.細(xì)胞形態(tài)及排列改變與機械力刺激時間、強度及應(yīng)力模式有關(guān),刺激時間越長、強度越大細(xì)胞形態(tài)及排列改變越明顯;壓縮性應(yīng)力細(xì)胞形態(tài)趨于類圓形改變,牽張性應(yīng)力細(xì)胞形態(tài)趨于梭形改變,交互應(yīng)力細(xì)胞形態(tài)及排列改變不明顯。2.不同時間、應(yīng)力模式及強度的機械力對細(xì)胞凋亡的影響存在差異,持續(xù)壓力作用下,細(xì)胞凋亡成一定的時間依賴性,時間越長細(xì)胞凋亡越明顯;固定刺激時間30min,不同模式的應(yīng)力刺激均可以促進細(xì)胞凋亡,持續(xù)壓力促進細(xì)胞凋亡作用強于周期性作用力;輕、中強度的刺激可以抑制細(xì)胞凋亡,而重強度的刺激對細(xì)胞的凋亡作用與力學(xué)性質(zhì)有關(guān),單一性質(zhì)壓力刺激抑制凋亡,組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)刺激促進細(xì)胞凋亡。3.機械力可以通過影響SPF而影響細(xì)胞增殖,持續(xù)壓力刺激對肌細(xì)胞的SPF及PI呈雙向調(diào)節(jié)作用,短時間(90min)抑制,長時間(120min)促進;刺激時間30min,周期性牽張應(yīng)力可以顯著增加SPF及PI;輕、中、強三種強度刺激均可增加SPF及PI,以輕、重刺激作用明顯。4.機械力刺激可以影響肌細(xì)胞的分泌,短時間(30min)、輕、中刺激顯著提升肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE_2和NO濃度及胞內(nèi)Ca~(2+)濃度,重刺激胞內(nèi)Ca~(2+)濃度與力學(xué)模式有關(guān),組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)機械力提升胞內(nèi)C a~(2+)濃度,單一性質(zhì)壓力無顯著影響;力的性質(zhì)而言,周期性牽張應(yīng)力可以顯著提升肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE_2和NO濃度及胞內(nèi)Ca~(2+)濃度;持續(xù)壓力、重刺激肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6濃度有降低趨勢。5.MyoD、Myf5蛋白的表達(dá)與機械力刺激時間、強度、性質(zhì)有關(guān),持續(xù)壓力作用,短時間(30min)促進MyoD、Myf5蛋白的表達(dá),但隨著時間延長促進作用減弱;刺激時間30min,MyoD、Myf5對周期性作用力敏感;不同強度單一性質(zhì)壓力刺激對MyoD、Myf5蛋白的表達(dá)無影響,組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)輕、中、強度刺激可以促進MyoD、Myf5蛋白的表達(dá)。結(jié)論:1.不同時間、應(yīng)力模式及強度的機械力引發(fā)的細(xì)胞生物力學(xué)效應(yīng)存在差異,細(xì)胞可以通過改變形態(tài)、周期、增殖與凋亡、分泌及蛋白的合成等力學(xué)組學(xué)形式來響應(yīng)機械力刺激,通過多層次的力學(xué)-化學(xué)-生物學(xué)耦合作用產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。2.細(xì)胞直接感受機械力刺激并調(diào)控生物信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是推拿手法發(fā)揮局部治療作用的效應(yīng)機制之一。3.合理的用力模式及時間、強度是推拿手法發(fā)揮治療效應(yīng)的關(guān)鍵因素。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R244.1;R-332
【圖文】：

對力學(xué)刺激的反應(yīng)基本上都是以信號傳遞的方式進行著的[24]于體內(nèi)外的機械信號通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的即時影響（如胞內(nèi)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為一定的電化學(xué)信號兩種模式在生物體內(nèi)進行傳遞的應(yīng)答和響應(yīng)（如細(xì)胞變形、力敏感型離子通道的激活、力學(xué)）方式，產(chǎn)生與之相應(yīng)的生物學(xué)行為改變[17,18,25]。在機械力的通過細(xì)胞層次的力學(xué)-生物學(xué)耦合（增殖、分化、凋亡及對機等）、分子層次的力學(xué)-化學(xué)耦合（蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分學(xué)-化學(xué)-生物學(xué)耦合作用引起局部效應(yīng)和整體效應(yīng)，從而對機調(diào)整[19-21,25]，它涉及細(xì)胞在力學(xué)載荷作用下細(xì)胞的各種力學(xué)行與凋亡、代謝等一系列改變[26,27]，這種在機械力刺激下于細(xì)協(xié)同發(fā)生作用的過程稱為力學(xué)組學(xué)[20,21]（細(xì)胞受到的力學(xué)刺激應(yīng)答，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)與系統(tǒng)變化等，圖 1B）。A. B.

05個／mL，每孔加入 0.2mL 的細(xì)胞懸液體和 0.8mL 的培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種到 24 孔板，置于 37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng) 48h 后，每天取出 3 個孔的細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色 3min 后顯微鏡下進行細(xì)胞計數(shù)，連續(xù) 7 日，細(xì)胞每 2 天換一次液，根據(jù)計數(shù)結(jié)果使用 GraphPad Prism 軟件繪制細(xì)胞生長曲線。3 研究結(jié)果3.1 細(xì)胞形態(tài)原代骨骼肌細(xì)胞較小，呈圓形或類圓形，折光性較強，隨著培養(yǎng)時間的延長肌細(xì)胞開始增殖，形態(tài)逐漸延展變成梭形或紡錘形，并逐漸趨于融合（圖 1-1A）。貼壁細(xì)胞呈梭形、紡錘形或多角形，折光性較好（圖 1-1B）；隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增殖并逐漸融合形成肌管（圖 1-1C）。A.B. C.

成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 細(xì)胞鑒定α-骨骼肌肌動蛋白(α-Sarcometric Actin，α-SCA) 是骨骼肌特有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白[68]，通過對α-SCA免疫細(xì)胞化學(xué)染色可以與其它細(xì)胞鑒別。本實驗采用α-SCA單克隆抗體進行細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示 90%以上的細(xì)胞呈陽性（即肌細(xì)胞純度達(dá) 90%以上）胞漿染成紅色（圖 1-2A和B），細(xì)胞核為藍(lán)色（圖 1-2C），其他非骨骼肌細(xì)胞呈陰性；說明所培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞。A. B.C.

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本文編號：2790613