目的:宮頸癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一,在女性腫瘤中的發(fā)病率僅次于乳腺癌,而現(xiàn)有的抗腫瘤藥物仍然存在毒性大、療效較低等弊端,因此開發(fā)一種療效好且毒副作用小的抗宮頸癌藥物具有非常重要的意義。一直以來植物天然產(chǎn)物在開發(fā)新的治療惡性腫瘤藥物中一直占有重要的地位,Warangalone為柘樹果實(shí)(Fructus Maclurae Tricuspidatae)中分離得到的異黃酮類化合物,前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性,且對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7具有較好的抑制作用,但對(duì)其抑制腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制并不清楚。因此,我們從柘樹果實(shí)中提取、分離、純化得到Warangalone,然后通過體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞篩選,最后選用對(duì)Warangalone較為敏感的宮頸癌細(xì)胞系He La作為研究對(duì)象來探討Warangalone的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制。方法:1.柘樹果實(shí)活性成分Warangalone的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定以柘樹果實(shí)為原材料,甲醇作為溶劑浸提;乙酸乙酯萃取;采用硅膠柱和Sephadex LH-20層析柱等方法對(duì)乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化;通過NMR,MS,X單晶衍射對(duì)獲得的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。2.Warangalone體外抗腫瘤作用機(jī)制研究采用MTT法檢測(cè)Warangalone對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Si Ha、Caski、He La,人肝癌細(xì)胞Hep G2,人乳腺癌細(xì)胞M321和MCF-7,人正常肝細(xì)胞LO2,人正常腦膠質(zhì)細(xì)胞chem-5共8種細(xì)胞增殖的抑制作用,并計(jì)算出半抑制濃度IC50。最終選擇對(duì)Warangalone最為敏感的He La細(xì)胞作為研究對(duì)象,以不同濃度(0μM、10μM、20μM、30μM)的Warangalone作用不同時(shí)間(12 h、24 h、48 h、72 h)處理He La細(xì)胞,測(cè)定其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的劑量和時(shí)效關(guān)系;光學(xué)顯微鏡觀察Warangalone對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;Hochest 3342染色觀察其對(duì)細(xì)胞核凋亡形態(tài)的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響;PI單染檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期分布的影響;Annexin-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;JC-1染色檢測(cè)其對(duì)線粒體膜電位的影響;DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞的ROS水平;Western blot測(cè)定Warangalone對(duì)He La細(xì)胞信號(hào)凋亡通路Bcl-2家族、Caspase家族、細(xì)胞色素C、PARP的和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1.分離純化得到三個(gè)異黃酮晶體化合物:其中一個(gè)化合物是目標(biāo)化合物Warangalone另外兩個(gè)化合物分別是4'-O-Methylalpinumisoflavone和Alpinumisoflavone。2.Warangalone選擇性的抑制腫瘤細(xì)胞,且對(duì)宮頸癌細(xì)胞He La的抑制作用最為明顯。經(jīng)Warangalone處理后的He La細(xì)胞皺縮,透光度增加,貼壁下降,并且呈時(shí)間-劑量依賴性;Hochest 3342染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期凋亡結(jié)果顯示He La細(xì)胞核發(fā)生固縮,加藥后細(xì)胞凋亡峰Sub G1比率隨濃度的逐漸升高而增加;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)arangalone顯著的抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。3.經(jīng)Warangalone處理后的He La細(xì)胞發(fā)生凋亡,線粒體膜電位顯著下降,細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)累積,且He La細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例與藥物作用濃度呈劑量關(guān)系,表明Warangalone可顯著誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞He La的凋亡。4.Warangalone主要通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑和MAPK信號(hào)通路的相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡:通過caspase家族蛋白活性檢測(cè)和Western bloting檢測(cè)來對(duì)其凋亡通路進(jìn)行判斷,結(jié)果表明Warangalone主要通過影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax、Bad的表達(dá),下調(diào)Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá),誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C的釋放,活化caspase-9、caspase-3,最終PARP被切割而誘導(dǎo)He La細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步檢測(cè)Warangalone對(duì)p53和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)Warangalone能夠激活p53,抑制MAPK信號(hào)通路中ERK蛋白的磷酸化,增加p38的磷酸化水平,但對(duì)AKT和JNK無顯著影響。結(jié)論:Warangalone具有抗宮頸癌細(xì)胞He La活性,其凋亡通路為:Warangalone刺激He La細(xì)胞后引起細(xì)胞的ROS積累,引起細(xì)胞的氧化損傷,導(dǎo)致p53和MAPK家族信號(hào)通路的激活,進(jìn)而調(diào)控Bcl-2家族的表達(dá),通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,最終激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3,引發(fā)He La細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

1-3 異黃酮類化合物基本骨架結(jié)構(gòu)(A)；具有抗腫瘤生物活性異黃酮的化 the matrix structure of isoflavone (A); the structure of isoflavones with antitu雌激素作用于異黃酮在結(jié)構(gòu)上與人體的雌性激素相似，因此一些異黃酮表現(xiàn)物活性，能夠降低與雌激素有關(guān)的腫瘤發(fā)生率，主要通過以下幾：（1）競(jìng)爭(zhēng)性的與雌激素受體（ER）結(jié)合。Mense 等的研究發(fā)黃酮可通過與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的雌二醇競(jìng)爭(zhēng)雌激素受體，來減弱雌殖的作用[28]；（2）增加性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）的合成。料木素對(duì)絕經(jīng)期女性進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能夠提高絕經(jīng)婦女的白來降低血液中雌激素的水平[29]；（3）調(diào)節(jié)催乳素。研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)催乳素的分泌來預(yù)防和治療與其分泌相關(guān)的腫瘤如乳腺

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文則通過抑制和促進(jìn)半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來調(diào)控細(xì)胞凋亡[53]。研究表明異黃酮類物質(zhì)可通過線粒體途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。Lo 等研究發(fā)現(xiàn)黃豆苷元的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物 3,4,7-Trihydroxyisoflavone 可通過增加 ROS 水平，激活 p53 通路，進(jìn)一步引起線粒體內(nèi)源途徑相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2 和 caspase-9 上調(diào)，最終激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞 HeLa 凋亡[54]。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)大豆苷元通過上調(diào) Bax 基因、下調(diào) Bcl-2 家族基因來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞 HeLa 凋亡。

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 Warangalone 抗宮頸癌細(xì)胞 HeLa 的分子機(jī)制研究從柘果中分離純化的 Warangalone，通過高效液相進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示純度達(dá)到 95.8%,液相圖譜如圖 3-4 所示。實(shí)驗(yàn)開展前將稱取 30 mg 的Warangalone，用 3 mL 的 DMSO 溶解配成 10 mg/mL 的儲(chǔ)存液 4℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2838095