背景:近十幾年研究表明,脂肪酸作為一種天然產(chǎn)物,被認為具有多種生物活性,包括抗菌、抗癌和促進皮膚愈合等多種生物活性,同時也被認為是一種很有藥物開發(fā)價值的天然產(chǎn)物。然而對于促進皮膚愈合的相關(guān)分子機制研究的還不夠透徹。目的:探討五谷蟲脂肪酸提取物對大鼠皮膚創(chuàng)面促愈合的作用及分子機制研究。方法:(1)應(yīng)用索氏回流提取的方法提取中藥五谷蟲干粉中的脂肪酸;(2)應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定五谷蟲脂肪酸提取物的成分并計算其各成分的相對百分率;(3)動物在體實驗,分三組(凡士林空白組、五谷蟲脂肪酸提取物給藥組、金萬紅陽性對照組)局部涂抹給藥并檢測對急性皮膚創(chuàng)面的促愈合作用;創(chuàng)面愈合率檢測:透明膜描記法記錄創(chuàng)面愈合情況;創(chuàng)面組織形態(tài)學檢測:H/E染色觀察創(chuàng)面組織形態(tài)學改變,以及免疫組化染色檢測創(chuàng)面組織增殖情況;(4)體外試驗,觀察脂肪酸鈉鹽(FASS)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的活性作用及相關(guān)機制檢測:1)、應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測脂肪酸鈉鹽對HUVEC細胞的藥效及毒性作用;2)、血細胞計數(shù)方法檢測脂肪酸鈉鹽對HUVEC細胞的促增殖作用;3)、應(yīng)用劃痕實驗和Transwell實驗檢測脂肪酸鈉鹽(FASS)對HUVEC細胞遷移能力的促進作用;4)、體外血管形成實驗檢測脂肪酸鈉鹽對HUVEC細胞血管形成的促進作用;5)、ELISA試劑盒檢測脂肪酸鈉鹽促進細胞生長因子的釋放作用;6)、免疫熒光檢測脂肪酸鈉鹽對相應(yīng)目的蛋白在細胞內(nèi)表達情況的影響;7)、Western blot實驗檢測脂肪酸鈉鹽對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成相關(guān)信號通路蛋白表達如:PI3K/AKT、ERK1/2、p38 MAPK、和TGF/Smad3;8)、RT-qPCR檢測在脂肪酸鈉鹽激活相關(guān)的信號通路后觸發(fā)相關(guān)下游基因的表達情況。結(jié)果:五谷蟲脂肪酸提取物的成分鑒定都為中長鏈脂肪酸且高達77.31%的脂肪酸為不飽和脂肪酸;在體實驗時,我們發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用脂肪酸有效的促進了急性皮膚創(chuàng)面的愈合,組織形態(tài)學結(jié)果表明脂肪酸有效的促進了創(chuàng)面處的血管形成且細胞增殖活躍;在體外實驗中,我們發(fā)現(xiàn)脂肪酸鈉鹽有效的促進了血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及血管形成作用,并且明顯的提高了促血管形成的細胞生長因子VGEFA、PDGF、TGF-β的釋放,提高了與新生血管穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白CD31、α-SMA表達,并且有效的激活了AKT、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β/Smads等促進細胞增殖、遷移和促進血管形成相關(guān)的信號通路以及下游相關(guān)基因(Bcl-2、c-Myc、Bad、p53)的表達。結(jié)論:五谷蟲干粉脂肪酸提取物有效的增加了皮膚創(chuàng)面的血管形成,進而促進創(chuàng)面的愈合,這種作用主要是通過促進細胞生長因子VGEFA、PDGF、TGF-β的釋放,并激活A(yù)KT、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β/Smads等促進細胞增殖、遷移和促進血管形成相關(guān)的信號通路而實現(xiàn)的。同時,脂肪酸還增加了穩(wěn)定新生血管的蛋白CD31和α-SMA的表達�？傃灾�,中藥五谷蟲干粉脂肪酸在促進皮膚愈合中有一定的藥用研究和開發(fā)價值。
【學位單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 脂肪酸經(jīng) GC-MS 鑒定，其 TIC 圖，各組分的波峰圖及保留時間。圖 2 脂肪酸鈉鹽對 HUVEC 細胞的藥效及促進生長作用。 A：CCK-8 實驗檢測FASS 的藥效，B：血細胞計數(shù)檢測 FASS 促細胞增殖，與 control 組對比，*p< 0.05，** p< 0.01。3. 脂肪酸鈉鹽對 HUVEC 細胞促遷移作用

16圖 2 脂肪酸鈉鹽對 HUVEC 細胞的藥效及促進生長作用。 A：CCK-8 實驗檢測FASS 的藥效，B：血細胞計數(shù)檢測 FASS 促細胞增殖，與 control 組對比，*p< 0.05，** p< 0.01。3. 脂肪酸鈉鹽對 HUVEC 細胞促遷移作用應(yīng)用 Transwell 實驗和劃痕實驗檢測 FASS 對 HUVEC 細胞的促遷移作用，結(jié)果如圖 3 所示。如圖 3A、B 所示，F(xiàn)ASS 明顯促進了 HUVEC 細胞的遷移，且呈現(xiàn)濃度依賴作用。圖 3C、D 所示，F(xiàn)ASS 明顯促進了 HUVEC 細胞從上室膜遷移到下室膜，且細胞數(shù)目隨 FASS 濃度增加逐漸增多。

圖 3 脂肪酸鈉鹽對 HUVEC 細胞的遷移能力影響。A：劃痕實驗顯示 FASS 促細胞遷移，B：數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示各濃度的促遷移率，C：Transwell 實驗顯示遷移到膜下的細胞數(shù)目，D：數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示遷移的平均細胞數(shù)目。與 control 組對比，*p< 0.05，** p< 0.01。4. 脂肪酸鈉鹽體外促進血管形成脂肪酸鈉鹽促進 HUVEC 細胞在體外形成管腔作用，我們應(yīng)用 Matrigel 膠檢測細胞形成管腔情況，如圖 4 所示。圖 4A 顯示，隨著 FASS 濃度的遞增，HUVEC 細胞在體外形成管腔程度越好，表明 FASS 明顯促進了內(nèi)皮細胞的成管作用；圖 4 B 所示，利用 ImageJ 軟件分析血管形成圖可知，統(tǒng)計血管長度、血管分支長度和血管節(jié)點數(shù)等參數(shù)顯示，F(xiàn)ASS 明顯促進了各數(shù)值得增加。5. 脂肪酸鈉鹽促進細胞因子的釋放利用 ELISA 試劑盒檢測 FASS 促進細胞因子 VEGFA、PDGF 的釋放。在 FASS 作用后，細胞因子 VEGFA、PDGF 的釋放量如圖 5 所示。FASS 明顯促進了 VEGFA

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本文編號：2834164