目的:探討左歸丸(ZGW)“補(bǔ)腎益髓、充腦壯骨”治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的分子機(jī)制之一是通過對食欲素(Orexin-A)及其受體1(OX1R)和受體2(OX2R)的調(diào)節(jié)。方法:實(shí)驗(yàn)1:制作ZGW凍干粉使用50%甲醇溶液配制200 mg/ml的ZGW提取液,通過高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-MS/MS)對ZGW提取液的化合物圖譜進(jìn)行分析,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對ZGW中的化合物成分,并進(jìn)行含量計(jì)算。實(shí)驗(yàn)2:采用去卵巢法建立PMOP大鼠模型將50只4月齡雌性SPF級SD大鼠隨機(jī)分為模型組(OVX)、假手術(shù)組(Sham)、雌二醇組(50 μg/kg/d,OVX-E2)、ZGW低劑量組[2.3 g/kg/d凍干粉,OVX-ZGW(L)]和ZGW高劑量組[4.6 g/kg/d凍干粉,OVX-ZGW(H)]。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物;HE染色觀察左側(cè)股骨遠(yuǎn)端組織病理學(xué)變化;顯微CT對右側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨密度和骨小梁微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量和分析;實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白印跡法(Western blot)檢測海馬組織中食欲素A(Orexin-A)、食欲素受體1(OX1R),食欲素受體2(OX2R)和脛骨組織中Orexin-A、OX1R,OX2R,骨保護(hù)素(OPG)和核因子κB受體激活因子配體(RANKL)mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)3:ZGW含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向OB方向分化的影響制備ZGW含藥血清,設(shè)置10%DMEM組(Control),2.5%ZGW含藥血清-7.5%DMEM組(ZC),成骨誘導(dǎo)液組(OS),2.5%ZGW含藥血清-成骨誘導(dǎo)液組(ZCS)。通過MTT法觀察各組對BMSCs增殖的影響;堿性磷酸酶鈣鈷染色法檢測BMSCs向OB方向的分化,堿性磷酸酶(AKP)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中AKP的含量,qPCR法檢測Orexin-A、OX1R、OX2R、RUNX2、OPG和RANKL mRNA的表達(dá),Western blot檢測BMSCs中RUNX2、RANKL和OPG蛋白的變表達(dá)。實(shí)驗(yàn)4:拮抗劑對ZC干預(yù)BMSCs向OB方向誘導(dǎo)分化的影響MTT法檢測OX1R拮抗劑、OX2R拮抗劑和OX1R/OX2R雙重拮抗劑在200 μmol/L,100 μmol/L,10μmol/L,1μmol/L,100 nmol/L等濃度條件下對BMSCs的毒性影響。設(shè)置Control,ZC,ZCS,ZCS-10μmol/L OX1R拮抗劑組(OX1R10),ZCS-1μmol/LOX1R拮抗劑組(OX1R1),ZCS-100 nmol/LOX1R拮抗劑組(OX1R01),ZCS-10μmol/L OX2R拮抗劑組(OX2R10),ZCS-1 μmol/LOX2R拮抗劑組(OX2R1),ZCS-100 nmol/L OX2R拮抗劑組(OX2R01),ZCS-10 μmol/L OX1R/OX2R雙重拮抗劑組(OX1R2R10),ZCS-1 μmol/L OX1R/OX2R 雙重拮抗劑組(OX1R2R1),ZCS-100 nmol/L OX1R/OX2R雙重拮抗劑組(OX1R2R01),堿性磷酸酶法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中AKP的含量,堿性磷酸酶鈣鈷染色法檢測BMSCs向OB方向的分化,Western blot檢測BMSCs中RUNX2、RANKL和OPG蛋白的變化。結(jié)果:1.經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對,UHPLC-MS/MS共檢測出ZGW提取液1 1種化合物,分別為馬錢苷、莫諾苷、金絲桃苷、槲皮素、胡蘿卜苷、蛻皮甾酮、蘆丁、山奈酚、梓醇、薯蕷苷元、獐牙菜甙,含量為0.036‰、0.06‰、0.041‰、0.014‰、0.081‰、0.092‰、0.066‰、0.013‰、0.066‰、0.046‰和0.056‰。2.與Sham相比,大鼠卵巢摘除2個月后,大鼠體重顯著升高(P0.05),其血清中骨吸收標(biāo)記物Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(β-CTX)和抗酒石酸堿性磷酸酶b(TRAP5b)明顯升高(P0.01),骨形成標(biāo)記物骨堿性磷酸酶(BALP)和骨保護(hù)素(OPG)水平顯著下降(P0.01),BMD水平明顯降低(P0.01),骨小梁變薄、分離度增寬、順序排列紊亂、骨小梁斷裂和骨空泡增多,股骨強(qiáng)度變?nèi)豕晒秋@微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。此外,OVX組大鼠海馬OX1R和脛骨OX2R、RANKL mRNA和蛋白表達(dá)水平較Sham明顯升高(P0.05,P0.01),而脛骨Orexin-A、OPG、OX2R和腦中Orexin-A、OX2R mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.05,P0.01)。與OVX組相比,給藥1個月后,OVX-ZGW(L)和OVX-ZGW(H)組對大鼠體重?zé)o明顯影響(P0.05),給藥3個月后,OVX-ZGW(L)、OVX-ZGW(H)和OVX-E2組大鼠體重顯著降低(P0.01)。同時,ZGW顯著提高去卵巢大鼠血清中骨形成標(biāo)記物BALP和OPG水平(P0.01),抑制骨吸收標(biāo)記物β-CTX)和TRAP5b水平(P0.01),增強(qiáng)骨小梁數(shù)量,減少骨空泡和骨小梁分離度,改善骨密度和骨顯微結(jié)構(gòu)水平,增強(qiáng)骨強(qiáng)度(P0.01)。此外,ZGW下調(diào)去卵巢大鼠中樞和脛骨中OX1R和RANKL mRNA和蛋白的表達(dá),上調(diào)中樞中Orexin-A mRNA,OX2R mRNA和蛋白以及外周骨中Orexin-A、OX2R和OPG mRNA或蛋白的表達(dá)水平(P0.01),但對中樞中Orexin-A的作用并不明顯(P0.05)。3.與Control組相比,MTT法顯示ZC對BMSCs的增殖能力作用有限(P0.05),堿性磷酸酶法顯示ZGW含藥血清培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中AKP含量無明顯變化(P0.05),堿性磷酸酶鈣鈷發(fā)染色顯示ZC組只有少量細(xì)胞核呈紫藍(lán)色,對BMSCs細(xì)胞中Orexin-A、OX1R、OX2R、RUNX2、OPG和RANKL mRNA和蛋白無明顯影響(P0.05)。與OS組相比,ZCS中的有大量細(xì)胞核呈紫藍(lán)色,AKP含量明顯升高(P0.01),BMSCs中Orexin-A、OX2R、RUNX2和OPG mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05,P0.01),RANKL和OX1R mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05,P0.01)。4.MTT法檢測顯示OX1R拮抗劑、OX2R拮抗劑和OX1R/OX2R雙重拮抗劑對BMSCs毒性影響最小的濃度范圍在10μmol/L,1μmol/L,100 nmol/L。與ZCS組相比,在孵育3天后,OX1R10組的AKP含量未見明顯變化(P0.05),OX2R10和OX1R2R10組的AKP含量明顯下降(P0.01);在孵育7天后,與ZCS組相比,OX1R10和OX1R2R10組的AKP含量明顯升高(P0.01),OX2R10組的AKP含量明顯下降(P0.05)。堿性磷酸酶鈣鈷染色結(jié)果顯示:與OS組相比,加入ZGW含藥血清后,BMSCs中的染色明顯較深;與ZCS組比較,OX1R10,OX1R1和OX1R01組的染色明顯變深,且OX1R10組顏色最深;OX2R10組,OX2R1組,OX2R01組染色明顯變淺,且OX2R10組顏色最淺;OX1R2R10組,OX1R2R1組,OX1R2R01組顏色變淺更為明顯,且OX1R2R10組顏色最淺。與ZCS組相比,OX1R10和OX1R1組中RUNX2和OPG蛋白表達(dá)顯著上升,而RANKL蛋白明顯下降(P0.05,P0.01);而OX1R01組中的RUNX2、OPG和RANKL蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與OX1R10組相比,OX1R1組和OX1R01組中RUNX2和OPG蛋白表達(dá)顯著下降,而RANKL蛋白則明顯上升(P0.01);與ZCS組相比,OX2R10組和OX2R1組中的RUNX2和OPG蛋白表達(dá)顯著下調(diào),而RANKL蛋白則明顯上升(P0.05,P0.01);OX2R01組中的RUNX2和OPG蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05),而RANKL蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);與OX2R10組相比,OX2R1組和OX2R01組中RUNX2和OPG蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而RANKL蛋白則顯著下降(P0.01);與ZCS組相比,OX1R2R10組和OX1R2R1組中的RUNX2和OPG蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而RANKL蛋白顯著上升(P0.05,P0.01);而OX1R2R01組中的RUNX2蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而OPG和RANKL蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05,P0.01);與OX1R2R10組相比,OX1R2R01組中的RUNX2和OPG蛋白表達(dá)顯著上調(diào),RANKL蛋白明顯下降(P0.05,P0.01),而OX1R2R1組中的RUNX2蛋白表達(dá)則顯著上調(diào),RANKL蛋白則明顯下降(P0.05,P0.01),但OPG蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.馬錢苷、莫諾苷、金絲桃苷、槲皮素、胡蘿卜苷、蛻皮甾酮、蘆丁、山奈酚、梓醇、薯蕷苷元、獐牙菜甙11種化合物成分可作為ZGW治療PMOP有效成分的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。2.左歸丸可雙向調(diào)節(jié)去卵巢大鼠血清中骨吸收和骨形成標(biāo)記物,提高骨小梁數(shù)量,減少骨空泡數(shù)量和骨小梁分離度,改善骨密度和骨顯微結(jié)構(gòu)水平,增強(qiáng)骨強(qiáng)度,同時左歸丸可下調(diào)去卵巢大鼠中樞中OX1R和骨中RANKL的表達(dá),上調(diào)中樞中Orexin-A和OX2R和外周骨中Orexin-A、OX2R和OPG mRNA和蛋白表達(dá)水平。3.單獨(dú)使用ZGW含藥血清,其對BMSCs的增殖及向OB方向分化的能力不明顯,但是聯(lián)合成骨誘導(dǎo)液后,其向OB方向分化的誘導(dǎo)能力顯著提高,效果優(yōu)于單獨(dú)使用左歸丸含藥血清或成骨誘導(dǎo)液。4.OX1R拮抗劑對ZGW-成骨誘導(dǎo)液干預(yù)BMSCs的增殖、向OB方向誘導(dǎo)分化具有促進(jìn)作用,而OX2R拮抗劑或OX1R/OX2R雙重拮抗劑對ZCS干預(yù)BMSCs的增殖和向OB方向誘導(dǎo)分化具有抑制作用。5.ZGW能夠改善圍絕經(jīng)期綜合癥,并且促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收、增加骨量、提高骨強(qiáng)度以及改善骨小梁顯微結(jié)構(gòu)水平的分子機(jī)制之一可能與對Orexin-A及其OX1R和OX2R受體的調(diào)節(jié)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文的水煎煮１邋ｈ，為第二次煎煮液。逡逑（３）將兩次煎煮液混合，過濾后進(jìn)行濃縮，濃縮到５０００邋ｍｌ時加龜板膠（２４０邋ｇ）角膠（２４０邋ｇ）進(jìn)行烊化。逡逑（４）將２５０邋ｍｌ的濃縮液加入專用冷凍干燥瓶內(nèi)，液氮迅速冷凍，上Ｆｒｅｅｚｅ邋Ｄｒｙｅｒｓ機(jī)－５０邋°Ｃ干燥。逡逑（５邋）邋４８ｈ取下凍干粉，粉碎后低溫干燥保存，得藥率為４９．５％邋（圖１－１）。逡逑

圖１－２邋ＺＧＷ凍干粉５０％甲醇提取物的正（Ａ）負(fù)（Ｂ）離子總離子色譜（ＴＩＣ）逡逑表１－２邋ＺＧＷ中主要檢測的化合物成分和含量邐逡逑序號邐化學(xué)名稱邐分子化學(xué)式邐分子量邋時間（ｍｉｎ）邋含量（９６。）逡逑１邐馬錢苷邐Ｃ１７Ｈ２６0ｉ０邐３９０．３８邐２．８７邐０．０３６逡逑２邐金絲桃苷邐Ｃ２１Ｈ２0０１２邐４６４．３７６３邐２．９２邐０．０４１逡逑３邐蛻皮甾酮邐Ｃ２７Ｈ４４0７邐４８０．６３邐３．０１邐０．０９２逡逑４邐胡蘿卜甾醇邐Ｃ３５Ｈ６０Ｏ６邐５７６．８５邐３．０５邐０．０８１逡逑５邐莫諾苷邐Ｃ１７Ｈ２６0ｕ邐４０６．３８１７邐３．２７邐０．０６逡逑６邐蛻皮甾酮邐５２０．６５邐３．５邐０．０２３逡逑７邐蘆丁邐Ｃ２７Ｈ３０Ｏ１６邐６１０．５１邐３．７４邐０．０６６逡逑８邐胡蘿卜甾醇邐Ｃ３５Ｈ６Ｑ０６邐５７６．８５邐３．８１邐０．０７逡逑９邐山奈酚邐Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６邐２８６．２３邐４．７邐０．００６逡逑１０邐山奈酚邐Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６邐２８６．２３邐４．７８邐０．０１３逡逑１１邐梓醇邐Ｃ１５Ｈ２２Ｏ１０邐３６２．３３邐６．７邐０．０６６逡逑

圖２－２顯微ＣＴ檢測的局部骨密度和骨顯微結(jié)構(gòu)區(qū)立逡逑邋中打開邋Ｃｕｓｔｏｍ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，點(diǎn)邋Ｂａｔｃｈ邋ｍａｎｇｅｒ邋進(jìn)行邋Ｔａｓｋ邋ｌｉｓｔ邋各項(xiàng)參數(shù)：Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ，邋ｌｏｗ：邋１１０，ｈｉｇｈ：ｌａｔｉｏｎ，３Ｄ邋ｓｐａｃｅ，Ｋｅｎｅｌ：邋Ｒｏｕｎｄ，邋Ｒａｄｉｕｓ邋１０，邋Ａｐｐｌｙ邋ｔｏ：ｇｉｃａｌ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｔｙｐｅ：邋Ｄｉｌａｔｉｏｎ，邋２Ｄ邋ｓｐａｃｅ，邋Ｋｅｎｅｌ：ｏｆ邋ｉｎｔｅｒｅｓｔ；邋３Ｄ邋ｍｏｄｅｌ，邋Ａｐｐｌｙ邋ｔｏ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＲＯＩ，邋ＤｏｕＲＯＩ文件圖片添加到Ｂａｔｃｈ邋ｍａｎｇｅｒ中進(jìn)行處理，圖在ＣＴｖｏｌ軟件中處理，根據(jù)需要進(jìn)行旋轉(zhuǎn)調(diào)整，骨強(qiáng)度逡逑檢測，將右側(cè)股骨從－８０邋°Ｃ冰箱取出，放４°Ｃ冷庫，并對準(zhǔn)載荷頭；股骨兩端髕骨面朝上放置于兩點(diǎn)支

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6 李瀚e

本文編號：2834133