鉤吻(Gelsemium elegans Benth,GEB)是馬錢科胡蔓藤屬植物,又名斷腸草、豬人參、大藥茶等。它的主要活性成分為生物堿,包括鉤吻素子(Koumine,Kou)、鉤吻素甲、鉤吻素寅、鉤吻素卯和鉤吻素丙等,具有抗腫瘤、止痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗焦慮等多種生物學(xué)功能。其中,Kou的含量最為豐富,具有與鉤吻總堿相似的生物學(xué)功能,但毒性相對較小。針對鉤吻在豬和人機(jī)體出現(xiàn)的不同現(xiàn)象以及其抗腫瘤的現(xiàn)象,我們將Kou作為研究對象,從細(xì)胞水平上揭示Kou對豬細(xì)胞和人細(xì)胞的不同調(diào)節(jié)作用以及其抗腫瘤的分子機(jī)理。此外,還構(gòu)建了四環(huán)素(Tetracycline,Tet)誘導(dǎo)利用Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控的Vero-TR母細(xì)胞,建立Tet誘導(dǎo)表達(dá)或沉默DEC1的Vero細(xì)胞系,作為一種后續(xù)研究的工具。主要的研究內(nèi)容包括:1.研究Kou對豬細(xì)胞和人細(xì)胞的不同調(diào)節(jié)作用首先,在顯微鏡下觀察Kou對豬細(xì)胞(PK15和IPECJ2細(xì)胞)和人細(xì)胞(H1299、RKO和MCF7細(xì)胞)的細(xì)胞形態(tài)變化的影響。其次,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了 Kou對不同細(xì)胞的生長周期的影響。進(jìn)一步采用細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞集落形成試驗(yàn)分析了Kou對不同細(xì)胞生長的影響,同時(shí)Western Blot檢測細(xì)胞中PARP1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Kou能夠使人的細(xì)胞(H1299、RKO和MCF7)發(fā)生不同程度的細(xì)胞形態(tài)的變化,甚至出現(xiàn)細(xì)胞死亡。相比之下,豬的細(xì)胞不出現(xiàn)或出現(xiàn)輕微的細(xì)胞形態(tài)變化。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Kou使PK15和IPEC-J2細(xì)胞的生長周期阻滯在G1期,而使H1299、RKO和MCF7細(xì)胞的生長周期阻滯在G2/M期。通過細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞集落形成試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Kou可以顯著抑制人細(xì)胞的增殖,而且這種抑制是不可逆的。而Kou對豬細(xì)胞生長的抑制并不明顯,且這種抑制是可逆的。Western Blot的結(jié)果顯示,Kou可以使RKO和MCF7細(xì)胞中的PARP1蛋白發(fā)生剪切,導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。而Kou對豬的細(xì)胞中PARP1蛋白表達(dá)的無明顯影響。2.研究Kou抗腫瘤活性的分子機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),Kou能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。通過Western Blot的方法,我們檢測了不同腫瘤細(xì)胞中,促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶7(Caspase7)和PARP1蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)通過分離線粒體和細(xì)胞質(zhì)的方法,檢測了細(xì)胞色素C在細(xì)胞內(nèi)的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Kou可以引起RKO和MCF7細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量的增加以及Bcl-2蛋白表達(dá)量的降低,并使細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞質(zhì)中,使細(xì)胞內(nèi)的Caspase7和PARP1蛋白發(fā)生剪切,最終出現(xiàn)細(xì)胞的凋亡,而在Vero和H1299細(xì)胞沒有檢測到相應(yīng)的變化。因此,Kou可以通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)RKO和MCF7細(xì)胞的凋亡。3.四環(huán)素調(diào)控DEC1表達(dá)的Vero細(xì)胞系的的構(gòu)建試驗(yàn)將表達(dá)Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein,TetR)的pcDNA6轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞,通過Blasticidin篩選穩(wěn)定表達(dá)TetR的陽性細(xì)胞克隆,即Vero-TetR母細(xì)胞系。將克隆有DEC1基因CDS區(qū)的pcDNA4真核表達(dá)載體或克隆有特異性靶向DEC1基因的shRNA的pBabe-Hl真核表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染至Vero-TR細(xì)胞,通過Zeocin或Puromycin篩選誘導(dǎo)表達(dá)或沉默DEC1的陽性細(xì)胞克隆,命名為Vero-DEC1和Vero-siDEC1。利用Wetern Blot檢測Vero細(xì)胞中Tet誘導(dǎo)表達(dá)或沉默DEC1的效果。最后成功構(gòu)建了 Vero-TR、Vero-DEC1和Vero-siDEC1的穩(wěn)定細(xì)胞系,WesternBlot結(jié)果顯示DEC1能夠在Tet的調(diào)控下有效表達(dá)或沉默。本研究以Kou為研究對象,我們發(fā)現(xiàn)了其對人細(xì)胞和豬細(xì)胞具有不同的調(diào)節(jié)作用,同時(shí),它還可以通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)RKO和MCF7細(xì)胞的凋亡,對不同腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性也有所差異。最后,Vero-TR母細(xì)胞系的成功構(gòu)建為建立其他宿主細(xì)胞基因表達(dá)或沉默的細(xì)胞系提供了重要材料,Vero-DECl和Vero-siDEC1細(xì)胞系的成功構(gòu)建為研究DEC1在正�；蚋腥镜葢�(yīng)激情況下的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S853.7;R285
【部分圖文】：

邐鉤吻素子對不同種屬細(xì)胞的作用及抗腫瘤活性的研究邐逡逑四環(huán)素與ＴｅｔＲ結(jié)合，使ｔＴＡ蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，不能與ＴｅｔＯ結(jié)合，從而阻遏ＴＲＥ逡逑下游基因的轉(zhuǎn)錄。而ｔｅｔ－ｏｎ表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建反義四環(huán)素激活子（ｒｔＴＡ），在有四環(huán)素逡逑或其衍生物Ｄｏｘ存在時(shí)，ｒｔＴＡ蛋白可與ＴＲＥ結(jié)合而促進(jìn)ＴｅｔＯ調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)，當(dāng)逡逑沒有Ｔｅｔ或Ｄｏｘ存在時(shí)，基因則不轉(zhuǎn)錄。逡逑我們研宄所采用的Ｔｅｔ－ｏｎ四環(huán)素（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，邋Ｔｅｔ）真核誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)由ｐｃＤＮＡ６逡逑和邋ｐｃＤＮＡ４／ｐＢａｂｅ－Ｈｌ邋組成，前者表達(dá)邋Ｔｅｔ邋阻遏蛋白（Ｔｅｔ邋ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＴｅｔＲ），與逡逑后者啟動子前的Ｔｅｔ操縱基因（Ｔｅｔｏｐｅｒａｔｏｒ，邋ＴｅｔＯ）邋ＤＮＡ序列特異性結(jié)合，阻遏下游逡逑基因／ｓｈＲＮＡ的表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞用Ｔｅｔ或其衍生物多西環(huán)素（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，邋Ｄｏｘ）處理時(shí)，逡逑Ｔｅｔ使ＴｅｔＲ的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致ＴｅｔＲ與ＴｅｔＯ分離，進(jìn)而啟動下游基因／ｓｈＲＮＡ的逡逑表達(dá)（圖邋２－１）邋［１’２］。ｐｃＤＮＡ６、ｐｃＤＮＡ４邋和邋ｐＢａｂｅ－Ｈｌ邋分別攜帶編碼邋Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ逡逑和Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ的抗性基因。逡逑

在第１天時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組和對照組均未有明顯的差異。第３天時(shí)，結(jié)果顯示逡逑Ｋｏｕ可以明顯抑制人細(xì)胞（Ｈ１２９９、ＲＫＯ和ＭＣＦ７）的增殖，而對豬的細(xì)胞（ＰＫ１５逡逑和ＩＰＥＣ－Ｊ２）和Ｖｅｒｏ細(xì)胞的影響不大（圖３－４和圖３－５）。逡逑ＡＢＣ逡逑Ｖｅｒｏ邐ＰＫ１５邐ＩＰＥＣ－Ｊ２逡逑ｃ？ｒｉ0ｉ—邐一邋『扣———一ｉ逡逑２邋８邋ｘ邋0邋８邋0邋８邋１逡逑＾邋６邋ｉ＼Ｌ邋ｘ邋６邋ｒｒ邋＞＜邋６逡逑１；邋ｐｉ４邋１｝邋Ｉ４＾邐１逡逑１邐２邋＾邋ｉｒｎｌｈ邋．．邐§邋２邐ｒ＾－，邋Ｉ邋ｉ邋§邋２邋ｍ逡逑５邐ｓ。ｊｌＩＩＩＬ邋ａ邋ｎ邋—［Ｉ．．．．．．．．ＩＬ逡逑０邐１邐３邐０邐１邐３邐０邐１邐３逡逑Ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邐Ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邐Ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ逡逑Ｈ１２９９邐ＲＫＯ邐ＭＣＦ７逡逑一邋１０］邐１邋一邋１０邋ｌ邐１邋一邋１０＾邐逡逑ｔｏ邐ｍ邐ｍ逡逑２邐８邐２邐Ｂ邐°邐８逡逑＞＜邋６邐Ｉ邐匕邋６逡逑１邋４邐ｈ邐｜邋４邐Ｉ邋４邐ａ逡逑畫邋２邋ｉ邋ｈ邋１１１邐｜邋２邋

結(jié)果顯示，１００邋ｐｇ／ｍＬＫｏｕ處理細(xì)胞后，在第４天時(shí)，顯微鏡下觀察到豬的細(xì)胞逡逑（ＰＫ１５和ＩＰＥＣ－Ｊ２）變化并不明顯，細(xì)胞緊密連接，均可形成細(xì)胞集落。人的細(xì)胞逡逑（Ｈ１２９９、ＲＫＯ和ＭＣＦ７）數(shù)目較少，細(xì)胞間的間隙變大（圖３－６）。細(xì)胞集落形成試逡逑驗(yàn)的結(jié)果顯示，ｌＯＯｐｇ／ｍＬＫｏｕ能夠抑制人細(xì)胞集落的形成，而對Ｖｅｒｏ和豬細(xì)胞集落逡逑形成影響不大。隨著藥物濃度的增加，１５０ｐｇ／ｍＬＫｏｕ能夠抑制豬細(xì)胞和Ｖｅｒｏ細(xì)胞的逡逑集落形成，而使人的細(xì)胞不能形成細(xì)胞集落（圖３－７）。逡逑Ｖｅｒｏ邐ＰＫ１５邐ＩＰＥＣ－Ｊ２邐Ｈ１２９９邐ＲＫＯ邐ＭＣＦ７逡逑１逡逑圖３－６邋Ｋｏｕ對不同細(xì)胞集落形態(tài)變化的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－６邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｋｏｕ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（Ａ－Ｆ）為對照組，未用Ｋｏｕ處理；（Ｇ－Ｌ）為實(shí)驗(yàn)組，ｌＯＯｐｇ／ｍＬＫｏｕ處理逡逑（Ａ－Ｆ）邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｏ＊ｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＢＳ；邋（Ｇ－Ｌ）邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ逡逑ｗｉｔｈ邋１００邋ｊｉｇ／ｍＬ邋Ｋｏｕ逡逑３０逡逑

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本文編號：2834206