目的探究烏頭湯延緩膝骨關節(jié)炎大鼠軟骨退變的抗炎作用機制,為烏頭湯的臨床應用提供實驗支持。方法1.從網絡藥理學角度,分析烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的藥效物質基礎與作用機制。2.復制膝骨關節(jié)炎大鼠模型后,隨機分為正常組、模型組、烏頭湯組與對照組(雙氯芬酸鈉),進行干預后置于麻醉下取材,后經HE染色、透射電鏡鏡下觀察軟骨組織的形態(tài)學與軟骨細胞超微結構變化;Western Blot法檢測P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量表達;酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測滑膜組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α含量表達。3.軟骨細胞體外培養(yǎng)體系的建立,甲苯胺藍染色與Ⅱ型膠原染色進行軟骨細胞的鑒定;使用倒置顯微鏡鏡下觀察軟骨細胞形態(tài);MTT法檢測烏頭湯對LPS誘導軟骨細胞活性影響;酶聯(lián)免疫吸附測定法分別檢測軟骨細胞上清液中NO、SOD的含量表達;RT-PCR、Western Blot分別檢測各組軟骨細胞與炎癥信號通路相關的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因與蛋白的含量表達。結果1.烏頭湯中的主要有效成分涵蓋生物堿類、黃酮類、皂苷類等化合物,可從p38MAPK、JNK、i NOS等信號途徑發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用,為深入研究其防治KOA的分子機制提供思路。2.HE染色結果顯示,烏頭湯組、對照組(雙氯芬酸鈉)淺表層切線與關節(jié)面基本平行且完整,移行層、輻射層、鈣化層及其他層次結構相對清晰可辨;透射電鏡觀察顯示,烏頭湯組、對照組(雙氯芬酸鈉)的軟骨細胞外形變化較小,呈類圓形,外層微絨毛附著,細胞核較大,異染色質、糖原顆粒與橢圓狀的線粒體散在分布,細胞器結構較為完整清晰;Western Blot結果顯示,與正常組比較,模型組的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表達升高(P0.01),與模型組比較,對照組、烏頭湯組的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表達降低(P0.05或P0.01);ELISA結果顯示,烏頭湯、對照組的滑膜組織中IL-1β、TNF-α含量表達均低于模型組(P0.01)。3.第2代軟骨細胞形態(tài)一致、胞核可視且清晰,生長狀態(tài)良好;經甲苯胺藍染色后,軟骨細胞胞內及其周圍區(qū)域可見紫紅色異染顆粒;經Ⅱ型膠原染色后,陽性對照組胞漿區(qū)呈棕黃色;MTT實驗結果顯示,烏頭湯水提物對LPS誘導軟骨細胞的最佳干預時間和濃度分別為24 h和150μg/m L;ELISA結果顯示,與模型組比,烏頭湯水提物組的NO含量表達低于模型組(P0.01),而SOD含量明顯高于模型組,尤其以150μg/m L組變化顯著(P0.01);RT-PCR、Western Blot法檢測結果顯示,烏頭湯水提物各濃度組(100、150、200μg/m L)對LPS誘導的軟骨細胞干預24 h后,均可改善與炎癥信號通路相關的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因與蛋白含量表達,尤其以烏頭湯水提物150μg/m L變化顯著(P0.01)。結論1.基于網絡藥理學研究表明烏頭湯可通過多途徑、多靶點發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。2.烏頭湯可改善膝骨關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨的形態(tài)結構,并下調關節(jié)軟骨、滑膜組織中與炎癥相關調節(jié)因子含量表達,延緩膝骨關節(jié)炎大鼠軟骨退變。3.烏頭湯通過降低LPS誘導的軟骨細胞中與炎癥相關調節(jié)因子含量表達,發(fā)揮抗炎作用。
【學位單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的網絡藥理學研究
    1 研究目的
    2 材料
        2.1 試驗藥物
        2.2 研究工具
    3 試驗方法
        3.1 烏頭湯的配體分子集建立
        3.2 烏頭湯的化學空間構建
        3.3 烏頭湯中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的化合物-靶點作用網絡構建
    4 結果
        4.1 烏頭湯的化學空間特征
        4.2 烏頭湯中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的化合物-靶點作用網絡
    5 討論
        5.1 中藥藥效物質基礎研究
        5.2 烏頭湯藥效成分研究
        5.3 烏頭湯的藥理作用研究
        5.4 從網絡藥理學研究烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的機理
    6 小結
第二部分 烏頭湯延緩膝骨關節(jié)炎大鼠軟骨退變的抗炎機制研究
    1 研究目的
    2 實驗材料
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
    3 實驗方法
        3.1 藥物制備
        3.2 動物分組、造模、干預、取材
        3.3 一般情況觀察
        3.4 滑膜組織觀察
        3.5 軟骨組織HE染色
        3.6 透射電鏡觀察軟骨細胞超微結構變化
        3.7 Western Blot檢測關節(jié)軟骨中p38MAPK、JNK、Ras、p-ERK1/2、iNOS蛋白含量表達
        3.8 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測關節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α含量表達
    4 統(tǒng)計學分析
    5 實驗結果
        5.1 一般情況觀察
        5.2 滑膜組織觀察結果
        5.3 軟骨組織HE染色結果
        5.4 透射電鏡超微結構觀察結果
        5.5 Western Blot結果
        5.6 ELISA檢測結果
    6 討論
    7 小結
第三部分 烏頭湯對LPS誘導大鼠軟骨細胞炎癥反應的影響
    1 研究目的
    2 實驗材料
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
        2.4 主要實驗用液配制
    3 實驗方法
        3.1 烏頭湯水提物的制備
        3.2 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
        3.3 LPS誘導軟骨細胞致炎模型的復制
        3.4 MTT比色試驗檢測軟骨細胞活性
        3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組軟骨細胞上清液NO、SOD含量表達
        3.6 RT-PCR法檢測軟骨細胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB mRNA含量表達
        3.7 Western Blot法檢測軟骨細胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、p-ERK1/2、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、p-IκB蛋白含量表達
    4 統(tǒng)計學分析
    5 實驗結果
        5.1 軟骨細胞鏡下觀察
        5.2 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化鑒定結果
        5.3 MTT檢測結果
        5.4 ELISA檢測結果
        5.5 RT-PCR檢測結果
        5.6 Western Blot檢測結果
    6 討論
    7 小結
結論
參考文獻
附錄
文獻綜述
    參考文獻
致謝
作者簡歷

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