【摘要】：目的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是臨床上常見的一種血管病變,是引起如冠心病、腦卒中等心腦血管系統(tǒng)疾病的病理生理基礎(chǔ)和主要原因,嚴(yán)重威脅人類的生命健康和生活質(zhì)量。本課題應(yīng)用ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠,給予高脂飲食,復(fù)制AS動物模型,并采用桂枝湯進(jìn)行干預(yù),從短期干預(yù)和長期干預(yù)動態(tài)觀察兩個方面,研究和探討桂枝湯對AS的調(diào)節(jié)機(jī)制,研究AS生物學(xué)基礎(chǔ),為臨床治療AS提供借鑒,并拓展桂枝湯臨床應(yīng)用范圍。方法1.采用ApoE-/--小鼠,給予高脂飼料(高脂飼料含78.85%基礎(chǔ)飼料、0.15%膽固醇、21%脂肪),復(fù)制AS動物模型。短期干預(yù)實驗分為野生普食組、ApoE-/-普食組、ApoE-/-高脂組、阿托伐他汀組、桂枝湯組;長期動態(tài)干預(yù)實驗分為野生普食組、ApoE-/-普食組、ApoE-/-高脂組、桂枝湯組。2.短期干預(yù):桂枝湯干預(yù)4周后,每組小鼠隨機(jī)分再為2組,一組進(jìn)行LPS腹腔注射,刺激3h后采用CBA法檢測各組小鼠血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平;另一組直接取材檢測:(1)常規(guī)生化檢測各組小鼠血脂水平;(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠外周血粒細(xì)胞比例及其表面CD36和TLR4表達(dá)、單核細(xì)胞比例及其表面CD36和TLR4表達(dá)、單核細(xì)胞亞型的比例;(3)病理檢測各組小鼠主動脈AS斑塊的形成情況;(4)實時熒光定量PCR檢測各組小鼠主動脈細(xì)胞因子的表達(dá)。3.長期動態(tài)干預(yù):桂枝湯干預(yù)18周,分別于干預(yù)6周、12周、18周后取材檢測:(1)檢測每周各組小鼠體重變化;(2)常規(guī)生化檢測各組小鼠血脂TC、LDL、HDL、TG水平,以及肝功能AST、ALT水平;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠外周血粒細(xì)胞比例及其表面CD36和TLR4表達(dá)、單核細(xì)胞比例及其表面CD36和TLR4表達(dá),以及單核細(xì)胞亞型比例;(4)懸液芯片技術(shù)檢測各組小鼠血漿細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、MCP-1、IFN-γ、NOS2、IL-1β 的表達(dá);(5)各組小鼠主動脈血管根部進(jìn)行病理切片,HE染色、油紅O染色,顯微鏡下觀察主動脈管壁AS斑塊的形成情況;(6)剝離主動脈血管,在體視鏡下觀察各組小鼠主動脈AS斑塊形成情況;縱向剖開主動脈血管進(jìn)行油紅O染色,鑒定主動脈AS斑塊形成情況;(7)實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組小鼠主動脈血管組織中細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果短期干預(yù)結(jié)果:1.與對照組比較,ApoE-/-普食組小鼠血漿HDL的表達(dá)顯著降低(P0.01),TC、LDL的表達(dá)顯著升高(P0.01),給予高脂可進(jìn)一步升高TC、LDL的表達(dá)(P0.01)。2.與ApoE-/-普食組比較,ApoE-/-高脂組小鼠外周血中單核細(xì)胞比例及單核細(xì)胞表面TLR4受體的表達(dá)、Ly6C++單核細(xì)胞比例顯著升高(P0.01),定居型Ly6C-單核細(xì)胞比例顯著降低(P0.01);給予桂枝湯干預(yù),可以顯著降低模型組小鼠外周血單核細(xì)胞表面受體CD36、TLR4的表達(dá),同時降低Ly6C++單核細(xì)胞比例,升高Ly6C-單核細(xì)胞比例(P0.01)。3.與ApoE-/-普食組比較,ApoE-/-高脂組小鼠外周血中炎癥因子IL-12p70、TNF的表達(dá)水平顯著升高(P0.01);與ApoE-/-高脂組比較,桂枝湯組小鼠外周血中IL-12、TNF、IFN-y的表達(dá)有下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.在主動脈病理切片中可觀察到,ApoE-/-高脂組小鼠主動脈血管檢測到動脈粥樣硬化的早期階段脂紋。5.與ApoE-/-普食組比較,ApoE-/-小鼠高脂組小鼠主動脈IL-6、MCP-1、IL-lβ的表達(dá)顯著升高(P0.01);桂枝湯短期干預(yù)可顯著抑制模型組小鼠血管的IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá);同時促進(jìn)血管TGF-β、IL-10、Arg-1等抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)(P0.01)。長期動態(tài)干預(yù)結(jié)果:1.與同周齡野生普食組比較,ApoE-/-高脂組小鼠的體重有增長趨勢,桂枝湯干預(yù)后可降低小鼠體重,且在干預(yù)6周后,ApoE-/-普食組小鼠增重量顯著高于野生普食組(P0.01)。2.與同周齡ApoE-/-普食組小鼠比較,ApoE-/-高脂6周、12周、18周組小鼠的TC、LDL的表達(dá)均顯著升高(P0.01),與短期結(jié)果一致。3.18周高脂飲食對ApoE-/-小鼠的肝功能ALT和AST沒有顯著影響;同樣,給予桂枝湯干預(yù)18周,ApoE-/-小鼠肝功能ALT、AST的表達(dá)也沒有顯著變化。4.與同周齡ApoE-/-普食組小鼠比較,ApoE-/-高脂飲食6周、12周、18周組小鼠外周血中單核細(xì)胞的比例顯著升高(P值分別為P0.01、P0.05、P0.05),;桂枝湯干預(yù)后有降低趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.與同周齡ApoE-/-普食組小鼠比較,ApoE-/-高脂6周組小鼠外周血中LyC6++的單核細(xì)胞比例有升高趨勢(P0.05),ApoE-/-高脂12周、18周組小鼠外周血中LyC6++單核細(xì)胞的比例顯著升高(分別為p0.01、p0.05);桂枝湯干預(yù)后均可顯著降低比例(P0.01)。6.與同周齡ApoE-/-普食組比較,ApoE-/-高脂18周組小鼠外周血中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-lβ、MCP-1、M-CSF、IL-10 有升高趨勢(P0.05);給予桂枝湯干預(yù)可抑制炎癥因子升高。7.6周、12周、18周后,HE染色檢測到ApoE-/-小鼠主動脈的進(jìn)展性AS斑塊;干預(yù)18周后,ApoE-/-高脂組小鼠主動脈主動脈內(nèi)膜、中膜明顯增厚,有大量脂質(zhì)沉積,纖維斑塊形成,基底膜破壞,油紅O染色陽性;桂枝湯干預(yù)后可抑制AS斑塊的形成、發(fā)展。8.6周、12周、18周后分別觀察各組小鼠大體主動脈組織發(fā)現(xiàn),野生普食組小鼠主動脈在體視鏡下均未見明顯斑塊;隨著干預(yù)時間的延長,可在體視鏡下觀察到ApoE-/-普食組小鼠主動脈管壁增厚,在干預(yù)12周后,在主動脈與頭臂干、頸總動脈及鎖骨下動脈分叉處可觀察到白色的脂肪組織,18周后AS斑塊面積增大,主動脈油紅O染色結(jié)果與大體觀察一致;ApoE-/-高脂組小鼠主動脈大體觀察表明,高脂飲食可進(jìn)一步增加ApoE-/-小鼠的AS斑塊,且隨時間的延長而加重;給予桂枝湯干預(yù)后則可明顯減少小鼠主動脈斑塊的面積。9.與同周齡ApoE-/-普食組比較,ApoE-/-高脂6周、12周、18周組小鼠主動脈炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1的表達(dá)顯著升高(P0.01);給予桂枝湯干預(yù)后可以顯著抑制ApoE-/-小鼠主動脈炎性細(xì)胞因子的表達(dá)(P0.01),同時也降低主動脈抗炎細(xì)胞因子TGF-β、IL-10的表達(dá)(P0.01)。結(jié)論高脂飲食導(dǎo)致ApoE-/-小鼠血脂水平升高,加速AS發(fā)生發(fā)展,加重機(jī)體免疫損傷。桂枝湯短期干預(yù)及長期動態(tài)干預(yù)可以降低高脂飲食的ApoE-/-小鼠全身炎癥反應(yīng)和主動脈血管局部的炎癥反應(yīng),且對局部炎癥反應(yīng)的抑制作用強(qiáng)于全身炎癥反應(yīng);桂枝湯調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)不依賴于血脂水平的改變;桂枝湯可抑制模型小鼠主動脈血管AS斑塊的形成、發(fā)展,為臨床AS的治療用藥及療程提供借鑒。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

中國中醫(yī)科學(xué)院二0一四級碩士研究生學(xué)位論文逡逑實驗結(jié)果逡逑１短期干預(yù)實驗結(jié)果逡逑１．１桂枝湯對血脂水平的影響逡逑與野生普食組小鼠比較，Ａｐ0Ｅｖ？普食組小鼠血漿ＴＣ、ＬＤＬ水平顯著升高逡逑（／＾Ｏ．Ｏｌ），ＨＤＬ水平顯著降低（ＰＯ．０１）；與ＡｐｏＥｖ？普食組小鼠比較，ＡｐｏＥ－ｚ？高脂逡逑組小鼠血漿ＴＣ、ＬＤＬ水平顯著升高（Ｐ＜０．０１）；與Ａｐ0Ｅｖ－高脂組比較，阿托伐組逡逑和桂枝湯組都沒有顯著改變血脂ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ和ＨＤＬ水平（Ｐ＞０．０５）。逡逑

圖２流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞、單核細(xì)胞亞型逡逑注：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中白細(xì)胞以及粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞亞型。逡逑Ａ表不根據(jù)前向側(cè)角散射信號（Ｆｏｒｗａｒｄ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＦＳＣ）和側(cè)向側(cè)角散射信號（Ｓｉｄｅ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＳＳＣ）逡逑區(qū)分出外周血中白細(xì)胞，從下至上分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群；Ｂ表示根據(jù)細(xì)胞逡逑表面標(biāo)記區(qū)分ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｒ為單核細(xì)胞，ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｌ＋為粒細(xì)胞；Ｃ表示根據(jù)單核細(xì)胞表面逡逑Ｌｙ６Ｃ的表達(dá)將單核細(xì)胞分為ＬｙＧＣ＇邋Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｃ－三群。逡逑１．３桂枝湯對外周血中粒細(xì)胞比例及其ＣＤ３６、ＴＬＲ４表達(dá)的影響逡逑Ｇ邐Ｇ－ＣＤ３６邐Ｇ－ＴＬＲ４逡逑６０－１邐１６－１邐６０－１逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑ｒ邐ｉ１０＇＊邐W 媝逡逑

＊ｍ：邋ｕ逡逑0邋ｊ邋■邐■邋？邋｜￣ｉ—ｉ￣■邋｜邋■邋？邋■＜邋－Ｔ＇邋■［邐，0邐Ｉ邋ｉ￣ｍ？ｈ邋■邋■邋＇邋■邋■邋■邋ｌ＂？邐１0邋－邋■—ｔ—ｉＴＴｗｙ邋ｉｖｒ，ｐｗｙ，ｉ邋？邋ｉ｜Ｈ？ｊ逡逑０邐２００邐４００邐６００邐８００邋ＩＫ邐１０°邐１0１邐１０：邐１0３邐１0４邐１０°邐１０’邐１0：邐１0３邐１０＊逡逑邐＞邋邐＞邋邐＞逡逑ＦＳＣ邐Ｇｒ－１邐Ｌｙ６Ｃ逡逑圖２流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞、單核細(xì)胞亞型逡逑注：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中白細(xì)胞以及粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞亞型。逡逑Ａ表不根據(jù)前向側(cè)角散射信號（Ｆｏｒｗａｒｄ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＦＳＣ）和側(cè)向側(cè)角散射信號（Ｓｉｄｅ邋Ｓｃａｔｔｅｒ，邋ＳＳＣ）逡逑區(qū)分出外周血中白細(xì)胞，從下至上分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群；Ｂ表示根據(jù)細(xì)胞逡逑表面標(biāo)記區(qū)分ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｒ為單核細(xì)胞，ＣＤｌｌｂ＋Ｇｒ－ｌ＋為粒細(xì)胞；Ｃ表示根據(jù)單核細(xì)胞表面逡逑Ｌｙ６Ｃ的表達(dá)將單核細(xì)胞分為ＬｙＧＣ＇邋Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｃ－三群。逡逑１．３桂枝湯對外周血中粒細(xì)胞比例及其ＣＤ３６、ＴＬＲ４表達(dá)的影響逡逑

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本文編號：2833065