目的:1.通過培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3細胞),研究在不同氧糖剝奪(OGD)模型時間下,bEnd.3細胞的增殖情況并選擇最優(yōu)OGD時間;2.在最優(yōu)OGD時間下,探究不同濃度活血定眩膠囊含藥血清對bEnd.3細胞的保護作用及與細胞自噬的關(guān)系,并完善活血定眩膠囊治療椎動脈型頸椎病的作用機理,為活血定眩膠囊的進一步臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:1.取生長狀況良好的bEnd.3細胞,傳代后分為5組,分別為正常對照組、OGD 3h組、OGD 6h組、OGD 9h組和OGD 12h組。先將其放在正常二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后,再按照上述分組將細胞進行OGD處理。OGD處理方法如下,首先將無糖DMEM培養(yǎng)基置于37℃,5%C0_2、94%N_2、1%0_2及飽和濕度的三氣細胞培養(yǎng)箱中低氧預(yù)處理30min。棄去各OGD組的舊培養(yǎng)基并置換成已低氧預(yù)處理的無糖DMEM培養(yǎng)基,然后將它們置于上述三氣細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3h、6h、9h和12h。正常對照組即為OGD 0h組,因而在共培養(yǎng)36h后,將其培養(yǎng)液更換為無糖DMEM,并直接進行檢測。運用普通光學顯微鏡觀察bEnd.3的細胞形態(tài)并拍照,比較對照組與OGD各處理組中細胞形態(tài)的變化并使用CCK-8檢測各組細胞活力。2.采用血清藥理學理論方法制備活血定眩膠囊含藥血清及空白血清。取生長狀況良好的bEnd.3細胞,在同一代下分為7組,分別為模型對照組、不同濃度活血定眩膠囊含藥血清OGD組(5%、10%、15%)、不同濃度空白血清OGD對照組(5%、10%、15%),先將其放在正常的二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞增殖到80%-90%密度時,再將各組的基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基,其次根據(jù)各組分組方式不同加入相應(yīng)的血清,其中模型對照組中不放任何血清,并根據(jù)上一部分的結(jié)果,所得到OGD最佳時間,將各組放入三氣細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)OGD最佳時間后取出,吸取細胞培養(yǎng)基上清液,采用比色法檢測細胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶(LDH)活性,采用硝酸根還原酶法檢測一氧化氮(NO);利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,運用Western Blot法檢測各組自噬指標LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、Beclin 1蛋白的表達,運用qPCR法檢測各組P62及Beclin 1 mRNA的表達,綜合以上結(jié)果分析活血定眩膠囊含藥血清對bEnd.3細胞的保護作用及與細胞自噬的關(guān)系。結(jié)果:1.在光學顯微鏡下,正常對照組中bEnd.3細胞為長條狀、梭型且分布規(guī)則,彼此相連,并呈絲網(wǎng)狀有序排列,而在OGD模型組(3h、6h、9h及12h)中,隨著時間的延長,bEnd.3細胞由原來的梭型逐漸往橢圓型發(fā)展,并在12h時,bEnd.3細胞大量死亡;通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),與正常組比較,OGD模型組在4個時間點OD值均呈現(xiàn)下降趨勢(P0.05),表明活隨著時間的延長,bEnd.3細胞活力逐漸下降,并且結(jié)合光學顯微鏡結(jié)果,隨著時間的推移,bEnd.3細胞凋亡率逐漸上升,且在OGD 12h時,細胞大量死亡。根據(jù)線性回歸方程:y=-0.1186x+1.7375(R2=0.9881)可得,當活細胞占比為50%時,OGD誘導(dǎo)時間大約需要7.3小時,根據(jù)本實驗結(jié)果,結(jié)合文獻可得,在本實驗中OGD誘導(dǎo)的最佳時間為6小時,確定6小時為OGD最佳時間。2.OGD誘導(dǎo)6小時后,與模型對照組相比,不同濃度含藥血清組及不同濃度空白血清組均能在不同程度降低LDH的釋放并增加細胞內(nèi)NO分泌從而減輕由于OGD模型造成bEnd.3細胞損傷從,表明大鼠血清能夠緩解細胞的損傷,并且降低細胞膜通透性;不同濃度空白血清組與不同濃度含藥血清組相比,在相同劑量下,活血定眩膠囊含藥血清均能顯著抑制細胞上清液中LDH的增加,并增強NO的量從而保護細胞,10%、15%的活血定眩膠囊含藥血清組差異顯著(P0.05),其中10%含藥血清組NO含量較其余各組最高,且差異顯著(P0.05)。在凋亡檢測中,我們發(fā)現(xiàn)模型對照組中bEnd.3細胞凋亡為35.5%。5%、10%、15%含藥血清組中bEnd.3細胞凋亡率分別為18.4%、5.7%、11.2%;而5%、10%、15%空白血清組中bEnd.3細胞凋亡率分別為25.7%、20.7%、15.3%。同等劑量的含藥血清組和空白血清組相比,各含藥血清能夠較好的抑制OGD誘導(dǎo)的bEnd.3細胞的凋亡率,且與其他各組相比,10%含藥血清組能夠明顯抑制bEnd.3細胞凋亡的進程。Western Blot的結(jié)果可知:(1)與模型對照組相比,5%、10%、15%的含藥血清組及5%、10%空白血清組中P62/β-Actin相對表達量均明顯下降(P0.05),而15%空白血清組P62/β-Actin相對含量較模型對照組升高(P0.05),而10%含藥血清組中P62/β-Actin相對表達量比其余各組都低(P0.05);(2)在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的數(shù)據(jù)中我們可以發(fā)現(xiàn),10%含藥血清組較其他各組有明顯升高(P0.05);5%、15%含藥血清組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值較5%、15%空白血清組有所上升(P0.05);(3)在Beclin 1/β-actin中,10%含藥血清蛋白相對表達量較其他各組有顯著性的上升(P0.05),5%藥血清組中Beclin 1/β-actin的相對含量小于5%空白血清組(P0.05),而在15%含藥血清組中,其含量高于15%空白血清組(P0.05)。qPCR結(jié)果表明:(1)含藥血清組中Beclin 1 mRNA(BECN-1)的含量高于同等劑量的空白血清組;在P62mRNA中,空白血清組的表達量明顯高于同等劑量含藥血清組,(2)模型對照組中P62mRNA表達量降低而BECN-1的表達量上升。結(jié)論:1.在不同OGD時間誘導(dǎo)下,6小時為bEnd.3細胞最佳誘導(dǎo)時間2.活血定眩膠囊含藥血清可顯著對抗OGD誘導(dǎo)的bEnd.3細胞損傷,明顯增強NO的含量,降低LDH的釋放,減少bEnd.3細胞凋亡的數(shù)量,促進bEnd.3細胞增殖。3.活血定眩膠囊含藥血清能夠通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3及下調(diào)P62蛋白的表達,來減輕OGD誘導(dǎo)的bEnd.3細胞的損傷,從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的功能。
【學位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

3）熱循環(huán)設(shè)置為：預(yù)變性 95℃ 5min,變性 95℃ 30s,退火 60℃ 15s,延伸 72℃ 32s，共 40 循環(huán)，溶解曲線分析溫度 60-95℃。記錄 CT 值。3.統(tǒng)計學方法應(yīng)用 SPSS21.0 軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ ± S）表示，多組之間結(jié)果比較采用單因素方差分析。以 P<0.05 為具有統(tǒng)計學差異。4.實驗結(jié)果4.1 鏡下觀察不同 OGD 時間誘導(dǎo)下 bEnd.3 細胞的形態(tài)正常組對照組中 bEnd.3 細胞呈梭型且分布規(guī)則，彼此間緊密相連，呈絲網(wǎng)狀有序的分列；在光鏡下，OGD 3h 組和 6h 組中 bEnd.3 細胞無明顯、肉眼可見的變化；OGD 9h組中，bEnd.3 細胞由原來的梭型逐漸往多邊型、橢圓型上發(fā)展，細胞整體呈膨脹狀態(tài)，細胞間隙增寬，排列不緊密；bEnd.3 細胞 OGD 干預(yù) 12h 后，部分細胞死亡，培養(yǎng)基中漂浮著大量的死細胞。說明隨著時間的推移，OGD 能夠誘導(dǎo) bEnd.3 細胞的損傷。

基于細胞自噬探討活血定眩膠囊含藥血清對 bEnd.3 細胞缺氧損傷的影響5、圖 2）表 5. 不同 OGD 時間對 bEnd.3 細胞活性的影響（ ± ，N=6）Table 5. Effect of different OGD time on the activity of bEnd.3 cells組別 OD 值 活細胞占比（%） F 值 P 值常對照組 1.701±0.113 100%288.255 P<0.GD 3h 組 1.462±0.066*86%GD 6h 組 1.016±0.110*60%GD 9h 組 0.595±0.052*35%GD 12h 組 0.355±0.040*21%常組比較，*P<0.05

基于細胞自噬探討活血定眩膠囊含藥血清對 bEnd.3 細胞缺氧損傷的影響表 6. OGD 誘導(dǎo)的 bEnd.3 細胞中 NO 和 LDH 的結(jié)果（ ± ，N=3）Table 6. OGD-induced results of NO and LDH in bEnd.3 cells組別 NO（μmol/L） LDH（U/L）5%含藥血清組 54.487±8.725*△473.783±13.545*△10%含藥血清組 63.462±9.172*△360.674±11.731*△15%含藥血清組 60.256±3.377*406.742±30.791*5%空白血清組 42.949±2.022△529.588±27.346△10%空白血清組 47.436±7.217*△472.659±18.946*△15%空白血清組 53.846±8.382*441.199±18.128*模型對照組 33.974±2.938 557.303±33.708注：*表示與模型對照組相比 P<0.01；△表示同等劑量的含藥血清組與空白血清組相比 P<0.01（同）

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本文編號：2832266