目的:1.探討酸楊桃根中DMDD對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)人骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗及炎癥因子的影響,為闡明DMDD是否可通過(guò)抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗提供理論依據(jù)。2.探討酸楊桃根中DMDD對(duì)高脂高糖加STZ誘導(dǎo)TLR4基因敲除糖尿病模型小鼠胰島素抵抗及炎性因子的影響,為闡明DMDD通過(guò)非TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善糖尿病模型小鼠胰島素抵抗的機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:1.通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)人骨骼肌細(xì)胞(HSKMC)建立胰島素抵抗細(xì)胞株模型,然后分組為:模型組(PA組)、陽(yáng)性對(duì)照組(二十二碳六烯酸(DHA)干預(yù)組)、DMDD高、中、低劑量組(DMDD High、DMDD Mid和DMD Low干預(yù)組);正常HSKMC作為正常對(duì)照組(Normal組)。1.1采用MTT法檢確定DMDD干預(yù)HSKMC細(xì)胞的合適濃度,PA誘導(dǎo)HSKMC的合適濃度,DHA干預(yù)HSKMC細(xì)胞的合適濃度;并通過(guò)葡萄糖濃度試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)性。1.2 DMDD對(duì)HSKMC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響:實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)Toll樣受體4(Toll-like Receptor,TLR4)、髓樣分化因子(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)、核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-a,TNF-α)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)mRNA的表達(dá);Western Blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、細(xì)胞核磷酸化NF-κB p65(NF-κB p65)、TNF-α、MCP-1蛋白的表達(dá)。2.將6~8周齡的雄性TLR4敲除基因C57BL/10小鼠及TLR4野生型FVB小鼠按隨機(jī)抽號(hào)的方法分成兩組:正常飲食(Normal)組及高糖高脂飲食(HFHSD)組,HFHSD組采用高糖高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后進(jìn)行STZ尾靜脈注射造模,注射劑量按120 mg/kg進(jìn)行注射。成功注射3日后尾靜脈檢測(cè)小鼠空腹血糖值、模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)為:血糖高于11.1mmol/L為造模成功糖尿病小鼠造模成功。將造模成功的小鼠進(jìn)行分組,分為C57BL/10模型組(C57BL/10 Model group)組、吡格列酮組(PIO group)、DMDD低劑量(DMDD Low)組、DMDD中劑量(DMDD Mid)組、DMDD高劑量(DMDD High)組;同時(shí)設(shè)為:FVB正常組(FVB Normal group)、FVB對(duì)照組(FVB Control group)(予高劑量DMDD長(zhǎng)期灌胃,作為長(zhǎng)期毒性檢測(cè))、C57BL/10正常組(C57BL/10 Normal group)。每組10只小鼠。隨后各組小鼠灌胃給藥28天,DMDD低、中、高組、PIO組的給藥劑量分別為:12.5、25.0、50.0、30 mg·kg~(-1);FVB對(duì)照組給予50.0 mg·kg~-11 DMDD;FVB正常組,C57BL/10正常組及C57BL/10模型組給予等體積的雙蒸水;給藥期間,每周稱(chēng)體重、隔周測(cè)FBG,給藥28天后進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)(OGTT)、第35天進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)、第42天進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)(IRT),第49天,取血,處死小鼠,測(cè)量如下指標(biāo):2.1生化分析儀檢測(cè)小鼠的血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯 (TG),低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,(AST)、堿性磷酸酶(ALP);2.2酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)血清胰島素(Insulin)、游離脂肪酸(FFA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、瘦素 (Leptin)、抵抗素(Resistin)及脂聯(lián)素(ADP),計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、葡萄糖耐量(OGTT)、胰島素耐量(ITT)、胰島素釋放試驗(yàn)(IRT);2.3 Real-Time PCR檢測(cè)肝臟及胰腺組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量;2.4 ELISA法檢測(cè)肝臟組織中丙二醛(MDA)的含量、總超氧化物歧化酶(SOD)的活性;2.5 HE染色法觀察肝臟組織及胰腺組織的病理變化;組織免疫化學(xué)法檢測(cè)MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,Bax、Bcl-2的表達(dá);2.6電子顯微鏡觀察小鼠胰腺及肝臟的變化;2.7 TUNEL法檢測(cè)胰島細(xì)胞及肝細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.與PA組比較,正常組,DHA組以及DMDD高,中,低劑量組培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度明顯降低,差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.01),說(shuō)明DMDD可以減少PA誘導(dǎo)HSKMC細(xì)胞的胰島素抵抗;2.與PA組比較,DMD High組、DMD Mid組、DMD Low組、DHA組中的TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA的含量水平降低,差異均具達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.05或P0.01),且呈劑量依賴(lài)關(guān)系;3.與PA組相比,DMD High組、DMD Mid組、DMD Low組、DHA組中的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、MCP-1的蛋白水平均下調(diào),差異均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.05或P0.01);4.與FVB正常組、C57BL/10正常組,FVB對(duì)照組中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)未見(jiàn)明顯差異,即在本研究時(shí)限內(nèi)DMDD對(duì)小鼠無(wú)毒性作用。5.與C57BL/10模型組比較,DMDD各劑量組小鼠的體重、FBG、TC、TG、LDL-C、ALT,AST及ALP的含量顯著降低,而HDL-C增加,(P0.05,P0.01);6.與C57BL/10模型組比較,DMDD治療組血清中的Insulin、FFA、TNF-α、IL-6、LEP、Resistin明顯降低(P0.05,P0.01);7.肝臟組織中MDA的含量顯著降低及SOD的活性明顯提高,(P0.05,P0.01);8.RT-PCR結(jié)果顯示,與FVB正常組,FVB對(duì)照組及C57BL/10正常組比較,肝臟及胰腺組織中的MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA被上調(diào)(P0.05,P0.01);與C57BL/10模型組比較,經(jīng)DMDD及吡格列酮治療后,MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-6基因mRNA下調(diào),(P0.05,P0.01);9.HE染色顯示治療組的肝臟脂肪變性明顯改善;與C57BL/10模型組相比,經(jīng)吡格列酮及DMDD治療后,胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基本完整;10.透射電鏡結(jié)果顯示:經(jīng)DMDD治療后,模型小鼠肝組織線粒體損傷減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改進(jìn),線粒體增加;胰腺組織線粒體損傷減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改進(jìn),β細(xì)胞和分泌顆粒增加;11.免疫組化顯示治療組的肝臟及胰腺組織中的MyD88、NF-κB,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、-8、-9及促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著減少(P0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2明顯增多;與FVB正常組,FVB對(duì)照組及C57BL/10正常組比較,C57BL/10模型組中凋亡的胰島細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.01);與C57BL/10模型組比較,各治療組的胰島細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P0.01)。結(jié)論:1.DMDD可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善由PA所致人骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗。2.從研究結(jié)果得出DMDD長(zhǎng)期使用未對(duì)小鼠漲生毒性作用。DMDD有可能避開(kāi)TLR4受體而通過(guò)NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善糖尿病模型小鼠胰島素抵抗,這也提示DMDD改善胰島素抵抗機(jī)制的多靶點(diǎn)抑制。另外我們肯定的是DMDD通過(guò)降低FFA進(jìn)而改善胰島素抵抗,從而改善糖尿病模型小鼠高糖、高脂狀態(tài),其具體分子機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1-1DMDD 安全給藥濃度的確定（ ± s, n = 6）（與 Normal 組比較，**p<0.01Fig.1-1 The safe concentration of DMDD （ ± s, n = 6）（**p<0.01 vs Normal group4.2 PA 誘導(dǎo)人骨骼肌細(xì)胞給藥的濃度以及二十二碳六烯酸( DHA ) 給濃度確定與正常組相比 100、200、400 μmol/L PA 組的人骨骼肌細(xì)胞活力下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001），且呈劑量依賴(lài)性。一般選活性為 60-70%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為造模濃度，當(dāng) PA 濃度為 200 μmol/L 胞活性降至 58.67%左右。我們本次研究選擇了 200 μmol/L 的 PA 濃度后續(xù)實(shí)驗(yàn) PA 誘導(dǎo)人骨骼肌細(xì)胞損傷的濃度。具體結(jié)果表 3-2 和圖 3-與正常組相比，100、200、400 μmol/L DHA 組的 200 μmol/L 的度誘導(dǎo)人骨骼肌細(xì)胞活力改變不明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0一般選擇細(xì)胞活性為 70-95%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為選擇陽(yáng)性濃度，當(dāng) DHA

酸楊桃根來(lái)源單體化合物 DMDD 抗胰島素抵抗型糖尿病的研究 2018 屆博士表 1-2 PA 誘導(dǎo) HSKMC 細(xì)胞損傷的濃度以及 DHA 給藥選擇濃度（ ± s, n = 6）Tab.1-2 The concentration of PA induced HSKMC cell damage and the concentration of DHAselected（ ± s, n = 6）Group OD cell activity（%）Normal 0.14 ± 0.03 92.12 ± 11.93400 μmol/L DHA 0.14 ± 0.01 97.59 ± 17.45200 μmol/L DHA 0.13 ± 0.02 91.01 ± 13.27100 μmol/L DHA 0.11 ± 0.01 80.70 ± 13.71400 μmol/L PA 0.09 ± 0.02 42.11 ± 8.22**200 μmol/L PA 0.09 ± 0.02 58.67 ± 11.71**100 μmol/L PA 0.12 ± 0.05 78.22 ± 19.05與 Normal 組比較，**p<0.01

DMDD 保護(hù) PA 誘導(dǎo)的 HSKMC 細(xì)胞損傷的濃度確定（ ± s, n = 6）（與 Nop<0.01；與 PA 組比較，##p<0.01）3 Protection of DMDD on PA induced HSKMC cell damage（ ± s, n = 6）（*p<0s Normal group；，##p<0.01 vs PA group）糖測(cè)試正常組相比，PA 組葡萄糖濃度明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示(P <0.01)；與 PA 組比較，正常組，DHA 組以及 DMDD 高，培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示沒(méi)有顯著1)。說(shuō)明 DMDD 可以減少 PA 誘導(dǎo) HSKMC 細(xì)胞的葡萄糖4，圖 1-4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳麗萌,李學(xué)旺,黃利偉,李艷,段琳,張小娟;2型糖尿病小鼠(KKA~y)動(dòng)物模型的鑒定和早期腎臟病理改變[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2002年01期

本文編號(hào)：2832626