氯化兩面針堿(Nitidine chloride,NC)是從蕓香科花椒屬植物兩面針(Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)的根、莖、葉等部位中提取得到的一種苯駢菲啶類生物堿,具有較強的抗腫瘤活性。有研究表明,NC具有抗腫瘤血管生成作用,能夠抑制人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖和遷移,下調HUVECs的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表達。然而,相關的分子機制尚未得到完全闡明。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信號級聯反應參與調節(jié)腫瘤細胞的血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的激活與分泌,調控腫瘤組織血管的生成。我們前期的酶活性檢測結果表明,NC對m TOR蛋白激酶的磷酸化具有抑制作用,m TOR是NC抑制腫瘤血管生成的潛在靶點。因此在本文中,通過動物實驗、細胞和分子生物學等實驗研究,并結合分子對接模擬,我們初步闡明了基于m TOR信號通路的NC抑制腫瘤血管生成的作用機制,為進一步將NC開發(fā)為多靶點的抗腫瘤藥物提供實驗依據。目的:1.評價NC對斑馬魚幼魚血管新生和裸鼠移植瘤組織血管生成的作用。2.研究NC對人肝癌細胞誘導的血管生成的作用。3.探討m TOR信號通路在NC抑制腫瘤血管生成中的調控作用。方法:1.以綠色熒光蛋白(GFP)標記血管的AB品系轉基因斑馬魚(基因型:mp805a)幼魚作為受試對象,評價不同濃度的NC對斑馬魚幼魚腸下靜脈叢發(fā)育的影響。2.建立人肝癌SMMC7721細胞裸鼠移植瘤模型,設立Control組、NC組、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)對照組和STAT3抑制劑S3I-201對照組共4個組,設定治療周期為15天。治療結束,將裸鼠麻醉后處死,取移植瘤組織,以蘇木素-伊紅(HE)染色法評價NC對移植瘤生長的影響,以透射電子顯微鏡(TEM)觀測移植瘤細胞的超微結構,以免疫蛋白印跡技術(western blotting)研究NC對移植瘤組織中VEGF、MMP2、m TOR、磷酸化m TOR(p-m TOR)、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)、STAT3和705位點酪氨酸殘基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Tyr705)等蛋白水平的影響。3.以微孔濾膜雙室聯合培養(yǎng)系統(Transwell)模擬人肝癌SMMC7721細胞誘導人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的增殖和遷移,評價NC對肝癌細胞誘導的血管生成的抑制作用。采用細胞免疫熒光技術觀測NC對人肝癌SMMC7721細胞中VEGF表達的影響4.采用western blotting技術檢測NC對人肝癌SMMC7721細胞內VEGF、MMP2、m TOR、p-m TOR、HIF-1α、STAT3、p-STAT3-Tyr705和727位點絲氨酸殘基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Ser727)等蛋白水平的影響。5.以酶活性檢測實驗評價NC對m TOR蛋白激酶磷酸化的抑制作用。借助計算機輔助藥物設計(computer aided drug design,CADD)軟件SYBYL2.0的Surflex-Dock分子對接模塊研究配體NC與受體m TOR激酶的相互作用。結果:1.與control組相比,NC組的斑馬魚幼魚腸下靜脈叢的發(fā)育受到明顯抑制,差異具有統計學意義(P0.001)。2.與Control組比較,各給藥組移植瘤的平均重量和體積均明顯變小(P0.05)。在HE染色結果中,Control組和S3I-201組的移植瘤組織中可見明顯新生血管和管壁中扁平的正常血管內皮細胞,未見到明顯的細胞壞死;與Control組相比,NC組和Rapa組的移植瘤組織出現大面積壞死,未見到新生血管。在TEM觀測結果中,Control組和S3I-201組的細胞形態(tài)正常,線粒體結構完整,染色質分布均勻;與Control組比較,NC組和Rapa組的細胞線粒體受到損傷,核內染色質固縮。3.Western blotting結果表明,與Control組比較,NC組和Rapa組移植瘤組織中的VEGF、MMP2、p-m TOR和HIF-1α等4種蛋白的表達均明顯下降,而S3I-201組的上述4種蛋白水平則明顯升高,差異均具有統計學意義(P0.05);此外,NC組、Rapa組和S3I-201組的p-STAT3-Tyr705蛋白表達水平均明顯下降,差異均具有統計學意義(P0.001)。4.Transwell實驗結果表明,與Control組相比,NC和Rapa均能抑制人肝癌SMMC7721細胞誘導的HUVECs細胞的遷移作用。細胞免疫熒光實驗表明,與Control組相比,NC組的SMMC7721細胞的VEGF表達受到抑制。5.細胞實驗的Western blotting檢測結果表明,與Control組比較,NC組和Rapa組的VEGF、m TOR、p-m TOR和HIF-1α等4種蛋白的表達均明顯下降(P0.05)。與Control組比較,NC組、Rapa組、S3I-201組的p-STAT3-Tyr705蛋白的表達水平均明顯下降,差異均具有統計學意義(P0.05)。6.酶活性檢測結果表明NC能夠抑制m TOR激酶的磷酸化,分子對接結果顯示NC與m TOR蛋白激酶主要通過氫鍵和范德華力相互作用。結論:1.NC對斑馬魚幼魚的血管生成具有抑制作用。2.NC可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長和血管生成。3.通過下調人肝癌SMMC7721細胞的VEGF水平,NC可以抑制SMMC7721細胞誘導的HUVECs細胞的遷移。4.m TOR是NC抑制腫瘤血管生成的作用靶點,NC通過m TOR/HIF-1α信號通路抑制腫瘤血管生成。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1-1 NC 對 72hpf 斑馬魚幼魚腸下靜脈叢形態(tài)的影響（A1-A7 代表空白組、5.24、6.55、8.19、10.24、12.8、16μmol / L NC 組，標尺：100μm）Figure 1-1 Effect of NC on the morphologies of the subintestinal veins of zebrafish larvaes at 72h(A1-A7 represents Control, 5.24, 6.55, 8.19, 10.24, 12.8, 16μmol / L NC group. Scale bars: 100μm

圖 1-2 NC 對 72hpf 斑馬魚幼魚腸下靜脈長度的影響（ x±s，n=6） Effect of NC on the length of the subintestinal veins of 72 hpf zebrafish larvaes ( x±s，* P＜0.001；vs Control group制人肝癌 SMMC7721 細胞裸鼠移植瘤的生長

圖 1-3 不同實驗組代表性的體內移植瘤Figure 1-3 Representative tumors in vivo in different experimental groups

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 金秋;劉華鋼;蒙怡;林彥妮;;氯化兩面針堿對斑馬魚胚胎血管生成的影響[J];中國藥理學通報;2013年11期

2 陳磊;劉怡;梁生旺;;模式生物斑馬魚在中藥研究中的應用[J];藥學學報;2012年04期

3 薛峪霖;肖安;文路;賈岳;高岳;朱作言;林碩;張博;;利用Tol2轉座子介導的增強子誘捕技術獲得血管相關轉基因斑馬魚系(英文)[J];生物化學與生物物理進展;2010年07期

4 郝天春;周林玉;汪小勇;宣強;曹正國;;HIF-1α和CXCR4在腎透明細胞癌中的表達[J];安徽醫(yī)科大學學報;2010年02期

5 劉麗敏;劉華鋼;;氯化兩面針堿的研究近況[J];時珍國醫(yī)國藥;2007年01期

6 周哲;谷小虎;;原發(fā)胃癌中VEGF檢測與臨床病理因素的相關性研究[J];實用腫瘤學雜志;2006年02期

7 常國棟,李壯林,秦加陽,馬翠卿,羅永章,許平;重組人血管內皮抑制素(rh-Endostatin)大腸桿菌表達體系發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];生物工程學報;2005年04期

相關碩士學位論文 前1條

1 紀艷麗;貝伐單抗-PLGA緩釋微球兔眼玻璃體腔注射的藥代動力學及藥物分布研究[D];大連醫(yī)科大學;2011年

本文編號：2826753