氯化兩面針堿(Nitidine chloride,NC)是從蕓香科花椒屬植物兩面針(Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)的根、莖、葉等部位中提取得到的一種苯駢菲啶類生物堿,具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。有研究表明,NC具有抗腫瘤血管生成作用,能夠抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖和遷移,下調(diào)HUVECs的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表達(dá)。然而,相關(guān)的分子機(jī)制尚未得到完全闡明。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信號級聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的激活與分泌,調(diào)控腫瘤組織血管的生成。我們前期的酶活性檢測結(jié)果表明,NC對m TOR蛋白激酶的磷酸化具有抑制作用,m TOR是NC抑制腫瘤血管生成的潛在靶點(diǎn)。因此在本文中,通過動物實驗、細(xì)胞和分子生物學(xué)等實驗研究,并結(jié)合分子對接模擬,我們初步闡明了基于m TOR信號通路的NC抑制腫瘤血管生成的作用機(jī)制,為進(jìn)一步將NC開發(fā)為多靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。目的:1.評價NC對斑馬魚幼魚血管新生和裸鼠移植瘤組織血管生成的作用。2.研究NC對人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的作用。3.探討m TOR信號通路在NC抑制腫瘤血管生成中的調(diào)控作用。方法:1.以綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記血管的AB品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚(基因型:mp805a)幼魚作為受試對象,評價不同濃度的NC對斑馬魚幼魚腸下靜脈叢發(fā)育的影響。2.建立人肝癌SMMC7721細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,設(shè)立Control組、NC組、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)對照組和STAT3抑制劑S3I-201對照組共4個組,設(shè)定治療周期為15天。治療結(jié)束,將裸鼠麻醉后處死,取移植瘤組織,以蘇木素-伊紅(HE)染色法評價NC對移植瘤生長的影響,以透射電子顯微鏡(TEM)觀測移植瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),以免疫蛋白印跡技術(shù)(western blotting)研究NC對移植瘤組織中VEGF、MMP2、m TOR、磷酸化m TOR(p-m TOR)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)、STAT3和705位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Tyr705)等蛋白水平的影響。3.以微孔濾膜雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Transwell)模擬人肝癌SMMC7721細(xì)胞誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖和遷移,評價NC對肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的抑制作用。采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀測NC對人肝癌SMMC7721細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響4.采用western blotting技術(shù)檢測NC對人肝癌SMMC7721細(xì)胞內(nèi)VEGF、MMP2、m TOR、p-m TOR、HIF-1α、STAT3、p-STAT3-Tyr705和727位點(diǎn)絲氨酸殘基磷酸化的STAT3(p-STAT3-Ser727)等蛋白水平的影響。5.以酶活性檢測實驗評價NC對m TOR蛋白激酶磷酸化的抑制作用。借助計算機(jī)輔助藥物設(shè)計(computer aided drug design,CADD)軟件SYBYL2.0的Surflex-Dock分子對接模塊研究配體NC與受體m TOR激酶的相互作用。結(jié)果:1.與control組相比,NC組的斑馬魚幼魚腸下靜脈叢的發(fā)育受到明顯抑制,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。2.與Control組比較,各給藥組移植瘤的平均重量和體積均明顯變小(P0.05)。在HE染色結(jié)果中,Control組和S3I-201組的移植瘤組織中可見明顯新生血管和管壁中扁平的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞,未見到明顯的細(xì)胞壞死;與Control組相比,NC組和Rapa組的移植瘤組織出現(xiàn)大面積壞死,未見到新生血管。在TEM觀測結(jié)果中,Control組和S3I-201組的細(xì)胞形態(tài)正常,線粒體結(jié)構(gòu)完整,染色質(zhì)分布均勻;與Control組比較,NC組和Rapa組的細(xì)胞線粒體受到損傷,核內(nèi)染色質(zhì)固縮。3.Western blotting結(jié)果表明,與Control組比較,NC組和Rapa組移植瘤組織中的VEGF、MMP2、p-m TOR和HIF-1α等4種蛋白的表達(dá)均明顯下降,而S3I-201組的上述4種蛋白水平則明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);此外,NC組、Rapa組和S3I-201組的p-STAT3-Tyr705蛋白表達(dá)水平均明顯下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。4.Transwell實驗結(jié)果表明,與Control組相比,NC和Rapa均能抑制人肝癌SMMC7721細(xì)胞誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的遷移作用。細(xì)胞免疫熒光實驗表明,與Control組相比,NC組的SMMC7721細(xì)胞的VEGF表達(dá)受到抑制。5.細(xì)胞實驗的Western blotting檢測結(jié)果表明,與Control組比較,NC組和Rapa組的VEGF、m TOR、p-m TOR和HIF-1α等4種蛋白的表達(dá)均明顯下降(P0.05)。與Control組比較,NC組、Rapa組、S3I-201組的p-STAT3-Tyr705蛋白的表達(dá)水平均明顯下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.酶活性檢測結(jié)果表明NC能夠抑制m TOR激酶的磷酸化,分子對接結(jié)果顯示NC與m TOR蛋白激酶主要通過氫鍵和范德華力相互作用。結(jié)論:1.NC對斑馬魚幼魚的血管生成具有抑制作用。2.NC可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長和血管生成。3.通過下調(diào)人肝癌SMMC7721細(xì)胞的VEGF水平,NC可以抑制SMMC7721細(xì)胞誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的遷移。4.m TOR是NC抑制腫瘤血管生成的作用靶點(diǎn),NC通過m TOR/HIF-1α信號通路抑制腫瘤血管生成。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1-1 NC 對 72hpf 斑馬魚幼魚腸下靜脈叢形態(tài)的影響（A1-A7 代表空白組、5.24、6.55、8.19、10.24、12.8、16μmol / L NC 組，標(biāo)尺：100μm）Figure 1-1 Effect of NC on the morphologies of the subintestinal veins of zebrafish larvaes at 72h(A1-A7 represents Control, 5.24, 6.55, 8.19, 10.24, 12.8, 16μmol / L NC group. Scale bars: 100μm

圖 1-2 NC 對 72hpf 斑馬魚幼魚腸下靜脈長度的影響（ x±s，n=6） Effect of NC on the length of the subintestinal veins of 72 hpf zebrafish larvaes ( x±s，* P＜0.001；vs Control group制人肝癌 SMMC7721 細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長

圖 1-3 不同實驗組代表性的體內(nèi)移植瘤Figure 1-3 Representative tumors in vivo in different experimental groups

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2826753