發(fā)布時(shí)間：2020-08-29 12:54

　　 背景和目的:鹿茸作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,含有多種促進(jìn)骨、上皮、血管及神經(jīng)等組織生長的活性蛋白質(zhì)及多肽類物質(zhì)。盡管如此,多肽的分離純化過程復(fù)雜、提取時(shí)間長、易失活、消耗原料多、回收率低,限制了鹿茸的藥用價(jià)值研究和市場推廣。本研究采用液相法合成一種鹿茸活性14-肽及其4個(gè)肽段,進(jìn)而評價(jià)它們對6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的保護(hù)作用,為進(jìn)一步開發(fā)抗帕金森病(PD)的藥物提供科學(xué)依據(jù)和研究思路。方法:(1)采用混合酸酐法合成鹿茸14-肽全長鏈EP_(14)及其4個(gè)肽段(EL_5、DL_5、EL_(10)和DP_9),并經(jīng)高效液相(HPLC)和電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)分析鑒定;(2)以300μmol/L 6-OHDA處理SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD模型組,各保護(hù)組以模型組為基礎(chǔ)分別加入不同濃度的合成肽段。以CCK-8法檢測合成肽段對PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用,Hoechst33258熒光染色及Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察合成肽段對PD細(xì)胞模型凋亡情況的影響。結(jié)果:(1)合理設(shè)計(jì)并成功合成5條目標(biāo)肽段;(2)CCK-8及Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與模型組比較,終濃度為200μg/mL DL_5、EL_(10)和EP_(14)保護(hù)組細(xì)胞存活率顯著升高且晚期凋亡率顯著降低(P0.05);(3)Hoechst33342染色結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈致密顆粒狀,而DL_5、EL_(10)和EP_(14)保護(hù)組細(xì)胞核固縮和碎裂均有所減少。結(jié)論:人工合成的鹿茸肽段DL_5、EL_(10)和EP_(14)可以通過抑制6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

氨基酸之間的縮合反應(yīng)，將不需要反應(yīng)的基團(tuán)保護(hù)起來，按照設(shè)計(jì)的方向進(jìn)行成肽反應(yīng)�；瘜W(xué)合成的多肽藥物具有合成周期短、生產(chǎn)量大等優(yōu)勢，能夠有效克服天然多肽藥物的不足，對于推廣多肽類藥物的應(yīng)用有重要意義[33]。多肽的體外合成方法一般包括化學(xué)方法、基因重組法和其他方法。1.2.1 化學(xué)合成法多肽的化學(xué)合成方法一般可以分為液相合成法和固相合成法。1.2.1.1 液相合成法多肽液相合成法是一種重要的多肽化學(xué)合成方法，具有合成純度高、易于純化等諸多優(yōu)點(diǎn)[34]。多肽液相合成法包括天然化學(xué)連接和施陶丁格連接兩種[35,36]。天然化學(xué)連接方法是近年來多肽和蛋白質(zhì)合成技術(shù)中最有效的途徑之一，也是目前最簡單和實(shí)用的多肽片段連接方法。施陶丁格連接法是根據(jù)疊氮反應(yīng)原理發(fā)展出來的一種多肽片段縮合方法。反應(yīng)原理分別如圖 1.1 和圖 1.2 所示：

圖 1.2 施陶丁格連接原理圖利用液相合成技術(shù)，Bang 等[37]通過 3 段縮合途徑成功合成了一種分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的含 46 個(gè)氨基酸殘基的多肽 Crambin。Batjargal 等[38]還利用該方法合成了具有硫代酰胺鍵（thioamide）骨架結(jié)構(gòu)的淀粉樣多肽 α-Synuclein，用以研究蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊及構(gòu)象變化。使用此方法成功合成的新型糖肽類抗生素雷莫拉寧Ramoplanin A2，在生物活性試驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的抗菌活性[39]。1.2.1.2 固相合成法1963 年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法[40]，截至目前，此方法已經(jīng)成為一種至關(guān)重要的多肽合成手段。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，一般從 C 端（羧基端）向 N 端（氨基端）合成。固相合成法又分為 Fomc 合成法和Boc 合成法。澳大利亞科學(xué)家 Mirand 等[41]應(yīng)用 Boc 方法快速合成了包括 HIV-1

序號 保留時(shí)間 峰面積 含量1 11.082 10523.654 0.19692 11.837 97149.477 1.81773 12.065 5214373.500 97.56184 12.065 22639.809 0.4236圖 2.1 EL5目標(biāo)肽段 HPLC 圖譜柱：SinoChrom ODS-BP(4.6 mm*250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相 ATFA/水；梯度：18%A-100%A, 30min；流速：1.0 mL/min；檢

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2808579