【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種現(xiàn)階段較常見(jiàn)的腸道慢性疾病,其主要的特征為炎癥反應(yīng)及組織損傷,基本上可以分為兩大類,分別為克羅恩病(crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、腹痛及血便等,對(duì)患者造成極大的痛苦,但是其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。白頭翁是一味歷史悠久的中藥,由于其具有“涼血解毒”的功效,已經(jīng)在腸阿米巴病、細(xì)菌感染、陰道滴蟲(chóng)病、瘧疾和惡性腫瘤的輔助治療中被廣泛應(yīng)用。Hederasaponin C(HSC)是白頭翁的主要成分之一,含量高達(dá)1%。但是對(duì)于HSC的進(jìn)一步藥理活性研究較少,并且沒(méi)有其對(duì)于IBD的治療作用的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)建立體內(nèi)UC及CD模型來(lái)系統(tǒng)性評(píng)估HSC抗IBD的療效,并闡明其作用機(jī)制,為IBD的治療提供新型候選藥物分子。1.HSC對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用HSC抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子表達(dá):分別采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的差異。LPS刺激后,細(xì)胞內(nèi)的白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的信使RNA表達(dá)量和蛋白含量明顯上升;HSC能夠明顯降低炎癥因子的表達(dá)及釋放,并且呈明顯的量效關(guān)系。HSC抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB的激活:分別采用免疫印跡試驗(yàn)和免疫熒光技術(shù),研究HSC對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子κB的影響。結(jié)果顯示,在RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的p-IKKα/β表達(dá)被HSC所抑制,且呈現(xiàn)劑量依賴性,而IκBα的表達(dá)提高,從而抑制了核轉(zhuǎn)錄因子κB的核易位。HSC抑制LPS誘導(dǎo)的Toll-樣受體4的二聚化:在HEK293T細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-TLR4和FLAG-TLR4,并且采用免疫共沉淀技術(shù)(IP)研究HSC對(duì)Toll-樣受體4二聚體形成的影響。結(jié)果表明,HSC可以抑制LPS誘導(dǎo)的受體的二聚化。2.HSC對(duì)大鼠炎癥性腸病的抑制作用在本研究中,我們首先建立了乙酸誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠克羅恩病模型,對(duì)HSC治療IBD的活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果提示HSC(2.5、5 mg/kg,腹腔注射)或美沙拉秦(200 mg/kg,灌胃口服)能夠抑制造模動(dòng)物體重下降率,改善造模動(dòng)物的疾病活動(dòng)指數(shù),降低腸質(zhì)量系數(shù),這一結(jié)果與造模組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)腸組織病理切片觀察結(jié)果提示模型組大鼠腸道組織見(jiàn)潰瘍形成,炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著,其間形成較多新生小血管,血管充血擴(kuò)張,部分區(qū)域見(jiàn)紅細(xì)胞滲出,而HSC給藥組及美沙拉秦組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,杯狀細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多,黏膜肌層未見(jiàn)組織水腫和充血,組織形態(tài)已明顯恢復(fù),且HSC給藥組的結(jié)腸恢復(fù)效果與美沙拉秦組相當(dāng)。3.HSC的初步安全性評(píng)價(jià)HSC與家兔的紅細(xì)胞懸液共孵育3小時(shí),未見(jiàn)明顯的溶血現(xiàn)象,表明HSC沒(méi)有溶血活性。采用MTT法檢測(cè)HSC對(duì)細(xì)胞生存率的影響,發(fā)現(xiàn)HSC對(duì)RAW264.7、HT-29、HEK293T細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響;取ICR小鼠,腹腔注射給藥HSC(5 mg/kg),觀察14天,HSC組小鼠的無(wú)行為異常及中毒現(xiàn)象的發(fā)生,體重與正常組比沒(méi)有差異。綜上所述,HSC能夠通過(guò)抑制TLR4的二聚化,從而阻斷TLR4/NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo),起到下調(diào)炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)及釋放的作用。體內(nèi)研究結(jié)果表明,HSC對(duì)于大鼠的結(jié)腸炎具有抑制效果,表現(xiàn)出顯著的抗IBD活性。該研究為IBD新藥物的創(chuàng)制提供了候選藥物分子。
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 Mean ±SD 方式進(jìn)行描述，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行 t 檢驗(yàn)分析或單因素方差分析。*p < 0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.3.1 HSC 對(duì) LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥因子（IL-6 和 TNF-α）的影響ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RAW 264.7 細(xì)胞經(jīng)過(guò) LPS 刺激 24 h 后，細(xì)胞上清中 TNF-α 和 1L-6 的含量均顯著的升高，與正常對(duì)照組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.01）。在 LPS 刺激前 1 h 用 1 μM 的 HSC 處理細(xì)胞，能夠明顯下調(diào) IL-6、TNF-α 的含量。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，HSC 可以抑制 LPS 刺激下的 RAW264.7 細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用。

圖 1.2 HSC 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響與 LPS 組比較，**p < 0.01，***p < 0.001；與對(duì)照組比較，###p < 0.001Figure 1.2 Effect of HSC on cytokine mRNAexpression in LPS-induced RAW264.7 cellsvs. LPS group, **p < 0.01, **p < 0.001; vs. control group, ###p < 0.0011.3.3 HSC 對(duì) LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞 COX-2 蛋白表達(dá)的影響用 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞，24 h 后細(xì)胞內(nèi) COX-2 蛋白水平明顯提高，與正常對(duì)照組比具有顯著性差異（P < 0.001）。而 HSC（0.1、1 μM）可以劑量依賴性的下調(diào) COX-2 的表達(dá)，1 μM HSC 劑量組與 LPS 組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.001）。

圖 1.2 HSC 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響與 LPS 組比較，**p < 0.01，***p < 0.001；與對(duì)照組比較，###p < 0.001Figure 1.2 Effect of HSC on cytokine mRNAexpression in LPS-induced RAW264.7 cellsvs. LPS group, **p < 0.01, **p < 0.001; vs. control group, ###p < 0.0011.3.3 HSC 對(duì) LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞 COX-2 蛋白表達(dá)的影響用 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞，24 h 后細(xì)胞內(nèi) COX-2 蛋白水平明顯提高，與正常對(duì)照組比具有顯著性差異（P < 0.001）。而 HSC（0.1、1 μM）可以劑量依賴性的下調(diào) COX-2 的表達(dá)，1 μM HSC 劑量組與 LPS 組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.001）。

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