【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種現階段較常見的腸道慢性疾病,其主要的特征為炎癥反應及組織損傷,基本上可以分為兩大類,分別為克羅恩病(crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。IBD的臨床表現主要為腹瀉、腹痛及血便等,對患者造成極大的痛苦,但是其具體發(fā)病機制尚不明確。白頭翁是一味歷史悠久的中藥,由于其具有“涼血解毒”的功效,已經在腸阿米巴病、細菌感染、陰道滴蟲病、瘧疾和惡性腫瘤的輔助治療中被廣泛應用。Hederasaponin C(HSC)是白頭翁的主要成分之一,含量高達1%。但是對于HSC的進一步藥理活性研究較少,并且沒有其對于IBD的治療作用的相關報道。本研究通過建立體內UC及CD模型來系統性評估HSC抗IBD的療效,并闡明其作用機制,為IBD的治療提供新型候選藥物分子。1.HSC對LPS誘導的炎癥反應的抑制作用HSC抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子表達:分別采用酶聯免疫吸附實驗和定量即時聚合酶鏈鎖反應檢測細胞炎癥因子表達的差異。LPS刺激后,細胞內的白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的信使RNA表達量和蛋白含量明顯上升;HSC能夠明顯降低炎癥因子的表達及釋放,并且呈明顯的量效關系。HSC抑制LPS誘導的RAW264.7細胞核轉錄因子κB的激活:分別采用免疫印跡試驗和免疫熒光技術,研究HSC對核轉錄因子κB的影響。結果顯示,在RAW264.7細胞中LPS誘導的p-IKKα/β表達被HSC所抑制,且呈現劑量依賴性,而IκBα的表達提高,從而抑制了核轉錄因子κB的核易位。HSC抑制LPS誘導的Toll-樣受體4的二聚化:在HEK293T細胞中同時轉染HA-TLR4和FLAG-TLR4,并且采用免疫共沉淀技術(IP)研究HSC對Toll-樣受體4二聚體形成的影響。結果表明,HSC可以抑制LPS誘導的受體的二聚化。2.HSC對大鼠炎癥性腸病的抑制作用在本研究中,我們首先建立了乙酸誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型三硝基苯磺酸誘導的大鼠克羅恩病模型,對HSC治療IBD的活性進行了初步評價。結果提示HSC(2.5、5 mg/kg,腹腔注射)或美沙拉秦(200 mg/kg,灌胃口服)能夠抑制造模動物體重下降率,改善造模動物的疾病活動指數,降低腸質量系數,這一結果與造模組相比有顯著統計學差異。結腸組織病理切片觀察結果提示模型組大鼠腸道組織見潰瘍形成,炎細胞浸潤顯著,其間形成較多新生小血管,血管充血擴張,部分區(qū)域見紅細胞滲出,而HSC給藥組及美沙拉秦組炎性細胞浸潤減少,杯狀細胞數量相對增多,黏膜肌層未見組織水腫和充血,組織形態(tài)已明顯恢復,且HSC給藥組的結腸恢復效果與美沙拉秦組相當。3.HSC的初步安全性評價HSC與家兔的紅細胞懸液共孵育3小時,未見明顯的溶血現象,表明HSC沒有溶血活性。采用MTT法檢測HSC對細胞生存率的影響,發(fā)現HSC對RAW264.7、HT-29、HEK293T細胞的增殖沒有影響;取ICR小鼠,腹腔注射給藥HSC(5 mg/kg),觀察14天,HSC組小鼠的無行為異常及中毒現象的發(fā)生,體重與正常組比沒有差異。綜上所述,HSC能夠通過抑制TLR4的二聚化,從而阻斷TLR4/NF-κB的信號傳導,起到下調炎癥因子IL-6和TNF-α的表達及釋放的作用。體內研究結果表明,HSC對于大鼠的結腸炎具有抑制效果,表現出顯著的抗IBD活性。該研究為IBD新藥物的創(chuàng)制提供了候選藥物分子。
【學位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

采用 SPSS 20.0 統計軟件對實驗數據進行統計分析。實驗數據以 Mean ±SD 方式進行描述，對實驗結果進行 t 檢驗分析或單因素方差分析。*p < 0.05表示具有統計學差異。1.3 實驗結果1.3.1 HSC 對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞分泌炎癥因子（IL-6 和 TNF-α）的影響ELISA 實驗結果表明，RAW 264.7 細胞經過 LPS 刺激 24 h 后，細胞上清中 TNF-α 和 1L-6 的含量均顯著的升高，與正常對照組相比具有顯著的統計學差異（P < 0.01）。在 LPS 刺激前 1 h 用 1 μM 的 HSC 處理細胞，能夠明顯下調 IL-6、TNF-α 的含量。因此，實驗結果充分表明，HSC 可以抑制 LPS 刺激下的 RAW264.7 細胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用。

圖 1.2 HSC 對 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞炎癥因子表達的影響與 LPS 組比較，**p < 0.01，***p < 0.001；與對照組比較，###p < 0.001Figure 1.2 Effect of HSC on cytokine mRNAexpression in LPS-induced RAW264.7 cellsvs. LPS group, **p < 0.01, **p < 0.001; vs. control group, ###p < 0.0011.3.3 HSC 對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞 COX-2 蛋白表達的影響用 LPS 刺激 RAW264.7 細胞，24 h 后細胞內 COX-2 蛋白水平明顯提高，與正常對照組比具有顯著性差異（P < 0.001）。而 HSC（0.1、1 μM）可以劑量依賴性的下調 COX-2 的表達，1 μM HSC 劑量組與 LPS 組比具有統計學差異（P < 0.001）。

圖 1.2 HSC 對 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞炎癥因子表達的影響與 LPS 組比較，**p < 0.01，***p < 0.001；與對照組比較，###p < 0.001Figure 1.2 Effect of HSC on cytokine mRNAexpression in LPS-induced RAW264.7 cellsvs. LPS group, **p < 0.01, **p < 0.001; vs. control group, ###p < 0.0011.3.3 HSC 對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞 COX-2 蛋白表達的影響用 LPS 刺激 RAW264.7 細胞，24 h 后細胞內 COX-2 蛋白水平明顯提高，與正常對照組比具有顯著性差異（P < 0.001）。而 HSC（0.1、1 μM）可以劑量依賴性的下調 COX-2 的表達，1 μM HSC 劑量組與 LPS 組比具有統計學差異（P < 0.001）。

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