【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌,致病性較強。由于抗生素及其他抗菌藥物的選擇性壓力,金葡菌形成多種耐藥性策略。耐藥性病原菌的進化及蔓延,尤其是超級耐藥菌株的出現(xiàn),對感染性疾病的治療以及人類的健康提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。因此,當務之急是尋找并研發(fā)治療細菌感染的新策略。金葡菌致病性的強弱主要取決于其所產(chǎn)生的各種毒力因子。金葡菌血管性血友病因子結(jié)合蛋白(vWbp)是影響金葡菌致病性的重要毒力因子,可將血液或者血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,沉積于菌體表面,加速凝血過程,同時形成的纖維蛋白屏障可抵抗宿主自身免疫系統(tǒng)的清除,促使感染局限化形成膿腫病灶以及血栓形成。此外,vWbp可促進金葡菌在導管表面的黏附以及腎膿腫形成。因此,以vWbp為抗毒力靶點,開展相關(guān)抑制劑的研究具有重要意義。抗毒力化合物與傳統(tǒng)的抗菌藥物截然不同,不影響細菌本身的生長活性,主要通過靶向金葡菌的毒力因子從而降低病原菌致病性。抗毒力化合物可使侵入的細菌處于易感狀態(tài),從而增強宿主自身的免疫清除作用和抗菌或殺菌活力。綿馬貫眾素是從鱗毛蕨科植物綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma Nakai)根莖和葉柄中分離出的一種間苯三酚衍生物,具有驅(qū)蟲、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用,還具有抗菌活性。但對于其能否通過影響vWbp活性,影響金葡菌致病性仍不可知。實驗目的:本實驗以金葡菌vWbp為藥物作用靶點,從200種中藥單體中篩選出其有效抑制劑即綿馬貫眾素,并研究該抑制劑對vWbp蛋白活性及金葡菌體外導管感染模型和金葡菌感染小鼠腎膿腫的影響。從而為以vWbp作為治療靶點,通過綿馬貫眾素降低金葡菌致病力提供理論依據(jù)。實驗方法:1.本研究首先構(gòu)建含有vWbp基因的過表達載體vWbp-p ET15b,用IPTG誘導表達,并用Ni柱親和層析純化目的蛋白;2.vWbp抑制劑篩選:通過金葡菌試管凝血實驗,從200種中藥單體中篩選無明顯抑菌活性的vWbp抑制劑,選取抑制效果較好的中藥單體即綿馬貫眾素作為后期實驗的研究對象;3.通過繪制綿馬貫眾素作用下金葡菌Newman的生長曲線,研究該中藥有無抑菌或殺菌活性;并通過蛋白免疫印跡研究該中藥能否影響vWbp蛋白的表達水平;利用金葡菌試管凝血實驗以及瓊脂糖平板實驗,進一步研究該中藥對vWbp蛋白活性的影響;4.通過DARTS(Drug Affinity Responsive Target Stability)實驗和Thermal Shift Assay實驗研究綿馬貫眾素與vWbp之間能否直接相互作用;5.通過構(gòu)建金葡菌體外導管感染模型和體內(nèi)金葡菌感染小鼠腎膿腫模型,研究綿馬貫眾素對金葡菌感染的實際治療效果。實驗結(jié)果:1.重組載體vWbp-p ET15b雙酶切后,在1527 bp處和5700 bp左右處各出現(xiàn)一條帶;SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導后較誘導前在66 k Da處出現(xiàn)一條差異明顯的條帶,經(jīng)Ni柱親和層析后在66 k Da處出現(xiàn)單一條帶。2.金葡菌試管凝血實驗結(jié)果顯示:vWbp的陽性對照組10 min內(nèi)就已完全凝固,綿馬貫眾素加藥組能夠明顯延長凝血時間,直至4 h才凝固。3.綿馬貫眾素作用下金葡菌的生長曲線與野生菌株無明顯差異;Western blot結(jié)果顯示:隨著綿馬貫眾素濃度升高,vWbp蛋白表達量沒有明顯變化。4.DARTS結(jié)果表明:隨著綿馬貫眾素濃度的增加,SDS-PAGE上殘留vWbp蛋白量隨之增加,Protase E對vWbp的消化作用則降低。反之,沒有加藥組,vWbp蛋白則被消化完全。5.Thermal Shift Assay結(jié)果顯示:綿馬貫眾素作用下,vWbp的Tm值與沒有加藥組相比,升高11℃,遠遠大于2℃(差異2℃即認為小分子與蛋白具有較強相互作作用)。6.金葡菌體外導管感染模型的掃描電鏡結(jié)果顯示:綿馬貫眾素作用下,粘附到導管表面的金葡菌大幅度降低,形成的纖維蛋白類的生物基質(zhì)也明顯減少。7.金葡菌感染小鼠腎膿腫模型的病理學研究顯示:野生金葡菌組可看到有明顯膿腫形成;而vWbp敲低組(△vWbp),腎膿腫大幅度減少,幾乎沒有膿腫形成;綿馬貫眾素作用組與△vWbp組作用效果相似。實驗結(jié)論:1.綿馬貫眾素512μg/m L不抑制金葡菌的生長,且不影響vWbp蛋白表達。2.綿馬貫眾素對vWbp的凝血活性有明顯抑制作用,存在劑量依賴性。3.綿馬貫眾素可直接與vWbp相結(jié)合,影響其活性及熱穩(wěn)定性。4.綿馬貫眾素可降低金葡菌在導管表面的粘附和纖維蛋白類生物基質(zhì)的形成。5.綿馬貫眾素對金葡菌感染小鼠腎膿腫模型有治療作用。6.綿馬貫眾素可通過抑制vWbp活性,降低金葡菌毒力。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2807139