【摘要】：研究背景:甘草次酸是從中藥甘草中分離得到的有效成分,研究證實甘草次酸具有抗腫瘤作用,同時在肝細(xì)胞中有豐富的結(jié)合位點,具有明確的肝靶向性。當(dāng)前,以甘草次酸為母核,通過結(jié)構(gòu)修飾,發(fā)現(xiàn)靶向抗癌藥物是國內(nèi)外研究的熱點。實驗室前期合成的TOGA與TNGA,是川芎嗪小分子與甘草次酸羧基位分別以酯鍵和酰胺鍵相連的化合物,通過體外活性測定發(fā)現(xiàn)兩結(jié)構(gòu)抗癌活性并不顯著。結(jié)合實驗室前期工作基礎(chǔ)及相關(guān)文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)引入氨基酸殘基對藥物活性增強有著重要作用,同時可降低細(xì)胞毒性,在一定程度上增強其靶向作用,為高效低毒抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)提供重要的方向。研究目的:本課題意在對實驗室前期合成的甘草次酸衍生物TOGA及TNGA深入進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并增強其抗腫瘤活性。基于甘草次酸結(jié)構(gòu)本身的靶向性,結(jié)合拼合原理及化合物活性改善方法,將氨基酸小分子引入衍生物結(jié)構(gòu)中,以提高其生物利用度及靶向性,進(jìn)而提高其抗癌活性。同時結(jié)合相關(guān)機制及成藥性探究,發(fā)現(xiàn)高效、低毒的靶向抗癌藥物。研究內(nèi)容:本實驗以TOGA及TNGA為結(jié)構(gòu)修飾前體,通過引入不同類型的氨基酸殘基合成系列甘草次酸氨基酸衍生物,并通過核磁、質(zhì)譜等手段確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)。將合成的系列化合物通過5種癌細(xì)胞模型(HepG2人肝癌細(xì)胞模型,Hela人宮頸癌模型,A549人肺癌模型,BGC-823人胃癌模型,MDCK犬腎上皮細(xì)胞)進(jìn)行活性評價,通過MTT法對化合物抗癌活性進(jìn)行驗證,篩選出高效低毒的優(yōu)勢化合物。后期對初步活性測定得到的優(yōu)勢化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究,確認(rèn)其起效官能團(tuán),推斷可能的作用機制并進(jìn)行驗證。對優(yōu)勢化合物的體外血漿及肝微粒體穩(wěn)定性進(jìn)行探究,結(jié)合藥代動力學(xué)、藥物體內(nèi)分布及裸鼠移植瘤實驗,對化合物成藥性及肝靶向性進(jìn)行初步評價,為新藥的后續(xù)開發(fā)提供必要的依據(jù)。研究結(jié)果:本實驗通過化學(xué)拼合原理合成甘草次酸氨基酸衍生物34個,通過細(xì)胞MTT實驗對其進(jìn)行體外抗癌活性篩選,結(jié)果顯示大部分化合物較起始物活性得到增強,其中化合物TOGA-X1,TOGA-X4,TOGA-X5,TOGA-X17抗癌效果甚至強于陽性藥順鉑,對MDCK正常細(xì)胞殺傷作用進(jìn)行評價后,最終得到高效低毒的抗癌先導(dǎo)化合物TOGA-X4。通過對化合物結(jié)構(gòu)母核及藥效基團(tuán)進(jìn)行替換增減,結(jié)合細(xì)胞活性實驗,對候選藥物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析,最終確定TOGA-X4為候選藥物。結(jié)合細(xì)胞染色法及流式細(xì)胞術(shù),發(fā)現(xiàn)TOGA-X4能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡。通過體外穩(wěn)定性實驗探究,發(fā)現(xiàn)化合物TOGA-X4在體外大鼠血漿孵育2 h后剩余化合物含量62.7%,體外大鼠肝微粒體孵育1h后剩余化合物含量71.3%,可認(rèn)為該化合物在體外基本穩(wěn)定。對TOGA-X4進(jìn)行微球制劑,提高其水溶性,通過大鼠尾靜脈注射進(jìn)行體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗,發(fā)現(xiàn)化合物在體內(nèi)血漿中6h和12h濃度明顯升高。通過動物體內(nèi)分布實驗探究,發(fā)現(xiàn)在心、肝、脾、肺、腎五個臟器中,化合物在肝臟中分布隨時間增加逐漸增多,最終趨于穩(wěn)定,可認(rèn)為該化合物具有明顯的肝靶向性。裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明,TOGA-X4給藥劑量為80mg/kg時,抑瘤率達(dá)49.5%,但在肝臟,腎臟和心臟中的耐受性和安全性與5-Fu相比要好得多,證明該化合物具有良好的安全性。研究結(jié)論:起始物TOGA和TNGA經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后,活性明顯增強,且TOGA衍生物抗癌活性普遍強于TNGA衍生物,其中篩選出的低毒高效候選藥物TOGA-X4能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞進(jìn)行有效殺傷,而對正常細(xì)胞殺傷較小,能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的早期凋亡。在體外血漿及肝微粒中能夠較為穩(wěn)定的存在,結(jié)合藥代動力學(xué)實驗,體內(nèi)分布實驗及藥效學(xué)實驗表明TOGA-X4能夠定向進(jìn)入肝臟中,具有良好的肝靶向作用。裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明該化合物具有良好的體內(nèi)抑瘤效果,達(dá)到了本課題的研究目的,為新藥的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

逡逑取“一步法”反應(yīng)液少量，處理后進(jìn)樣，如圖２－４液相色譜圖所示，峰１保留時間為逡逑５．５０６邋ｍｉｎ，結(jié)合薄層監(jiān)測，分離純化該反應(yīng)液，得到純度較高的峰１化合物，反應(yīng)產(chǎn)率逡逑５０％左右。通過質(zhì)譜對峰１進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，如圖２－５所示，確定該化合物為ＴＭＰ－Ｃ１。逡逑１逡逑ｆｔ邐Ｉ逡逑Ｉ邋＼邋Ｉ邋＼邐／邋＼逡逑邐］邋Ｖ＿＿！邋Ｖ．邋！邋＼邐邐邐邐邐逡逑0邐２．５邐５．０邐７．５邐１０．０邐１２．５邐１５．０逡逑ｃ／ｍｉｎ逡逑圖２－４邋“邋一步法”合成２－氯甲基－３，５，６－三甲基吡嗪反應(yīng)液ＨＰＬＣ色譜圖逡逑ｘＩＯ邋５｜邐、Ｎ邋八逡逑離邋４－邐１７．０６８２邋ｙ＾Ｃ，逡逑１逡逑１逡逑度ｈ逡逑°邋￣１００邋１２０邋１４０邋１６０邋１８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００逡逑ｍ＇ｚ逡逑圖２－５峰１化合物結(jié)構(gòu)解析逡逑２．１．３．２“四步法”反應(yīng)監(jiān)測結(jié)果逡逑對“四步法”每步反應(yīng)液進(jìn)行收集，分別處理進(jìn)樣，液相色譜圖觀察其反應(yīng)情況，通逡逑過對各步驟反應(yīng)液監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)“四步法”各步反應(yīng)產(chǎn)率較高，在實際操作過程中，可直接逡逑進(jìn)入下步反應(yīng)，減少了分離純化過程中帶來的化合物損失，最終反應(yīng)產(chǎn)率高達(dá)８０％。同逡逑時對各步反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析

圖２－７各步反應(yīng)產(chǎn)物離子流圖及結(jié)構(gòu)解析逡逑Ａ．步驟ａ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｂ．步驟ｂ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｃ．步驟ｃ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｄ．步驟ｄ反逡逑應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析逡逑對“一步法”與“四步法’’ＴＭＰ－Ｃ１反應(yīng)液進(jìn)行薄層監(jiān)測［Ｖ邋（二氯甲烷）：Ｖ邋（甲醇）逡逑＝邋１００：１］，如圖２－８所示，右側(cè)為ＴＭＰ－Ｃ１對照品，左側(cè)為反應(yīng)液，中間為交叉點；“一步逡逑法”薄層板監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物下方為川芎嗪原料，反應(yīng)不完全且雜質(zhì)較多，雜質(zhì)極性與反應(yīng)逡逑產(chǎn)物相近，較難分離；“四步法”薄層板監(jiān)測，原點為催化劑等強極性物質(zhì)，分離純化時逡逑不會對產(chǎn)物造成影響，如圖所示，該方法反應(yīng)較為完全，雜質(zhì)量少且極性與反應(yīng)產(chǎn)物相逡逑差較大，分離純化簡單易得。逡逑３８逡逑

Ｃ邐Ｄ逡逑圖２－６各步反應(yīng)液ＨＰＬＣ色譜圖逡逑Ａ．步驟ａ反應(yīng)液；Ｂ．步驟ｂ反應(yīng)液；Ｃ．步驟ｃ反應(yīng)液：Ｄ．步驟ｄ反應(yīng)液逡逑0逡逑ｘ１０６邐Ａ邐ｘ１０５逡逑１邋７５邐１５３，１０２０邐８｜邐１９５．１１２９邋ＶＮＹ＾0Ａｃ逡逑離１５邐ＸＸ邐氧ｉ邐＼邋入義逡逑子邋１．２５邐？邐Ｓ逡逑｜邐｜邋；逡逑兮０．７５邐號「逡逑強0５邐強＾逡逑？又邋０．２５邐汊邋１．邐２５３．１１８４逡逑°邐１００邋１邋２０邋１４０邋１６０邋１邋８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００邐°邐１００邋１２０邋１４０邋１６０邋１８０邋２００邋２２０邋２４０邋２６０邋２８０邋３００逡逑ｍ／ｚ邐ｍｌｚ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｘ１０６，邐、Ｎ邋ａ邐ｘｌＯ邋５［邐、Ｎ邋八逡逑＇邋１Ｔ邐“邋”一邋Ｘ（ＣＩ逡逑辜邋０．８＿邐Ｊ邐３－逡逑倍逡逑ｌ°＇６ｉ邐１邐－逡逑｜°１邐—邐１邋ｉ邐，逡逑ｆ。．２邋Ｉ邋，邐Ｉ逡逑0ｌ邋１００邋１；（ｉ邋ｊｊ0邋１６０邋１８０邋？６0邐２４０邋？６0＇邋＾0４0邐＾邋ｉ６0邋＿碩＿＿說邐？油輸洳洳妯邋３００逡逑ｍ／ｚ邐ｍ／ｚ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑圖２－７各步反應(yīng)產(chǎn)物離子流圖及結(jié)構(gòu)解析逡逑Ａ．步驟ａ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｂ．步驟ｂ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｃ．步驟ｃ反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析；Ｄ．步驟ｄ反逡逑應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析逡逑對“一步法”與“四步法’’ＴＭＰ－Ｃ１反應(yīng)液進(jìn)行薄層監(jiān)測［Ｖ邋（二氯甲烷）：Ｖ邋（甲醇）逡逑＝邋１００：１］，如圖２－８所示，右側(cè)為ＴＭＰ－Ｃ１對照品，左側(cè)為反應(yīng)液，中間為交叉點；“一步逡逑法”薄層板監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物下方為川芎嗪原料

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9 張

本文編號：2803135