發(fā)布時間：2020-08-19 10:44

【摘要】：目的:探討白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌細胞膜、細胞壁和液泡的作用及機制。方法:首先采用微量液基稀釋法檢測白頭翁湯正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction,BAEB)對白念珠菌的MIC_(80)和SMIC_(80)。針對白念珠菌細胞膜,通過spot assay觀察BAEB對白念珠菌細胞活性的影響;通過酶標儀檢測白念珠菌細胞內(nèi)甘油含量以反映白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓的變化;qRT-PCR定量檢測白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓相關基因的表達;通過熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌細胞膜通透性的影響;通過高效液相測定白念珠菌細胞膜中麥角甾醇的含量;qRT-PCR定量檢測白念珠菌細胞膜麥角甾醇合成相關基因的表達。針對白念珠菌細胞壁,Spot assay檢測BAEB、熒光白(Calcofluor white,CFW)、剛果紅(Congo red,CR)對白念珠菌細胞活性的影響;流式細胞儀和酶標儀檢測BAEB對白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖的影響;流式細胞儀檢測BAEB對白念珠菌細胞壁幾丁質的影響;qRT-PCR檢測白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成相關基因及幾丁質合成相關基因的表達;透射電鏡觀察白念珠菌細胞壁。針對白念珠菌液泡,通過熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌液泡膜的影響;qRT-PCR定量檢測BAEB對白念珠菌液泡合成相關基因表達的影響。結果:256、512、1024μg/mL BAEB干預下白念珠菌的菌落數(shù)逐漸減少,活性逐漸降低;512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌胞內(nèi)甘油含量分別為444.64±0.9nmol/mg、571.93±4.3 nmol/mg,和空白對照組相比甘油含量顯著性增多(P0.05),256、512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓的相關基因HOG1分別下調了9.1倍、9.3倍、5.5倍;512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光的細胞顯著增多;1024μg/mL BAEB干預后麥角甾醇峰面積為35.88495,與空白對照組對比有顯著性差異(P0.05);1024μg/mL BAEB干預組白念珠菌細胞膜麥角甾醇合成相關基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG10、ERG11、ERG13、ERG24、ERG25、ERG251、ERG26與UPC2分別下調了6.57、4.88、4.14、9.23、3.40、9.83、3.07、7.49、5.52、5.89、2.44、3.24、1.97、10.06倍。剛果紅、熒光白和BAEB組分別與白念珠菌空白對照組相比,活性均降低;256、512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖與幾丁質暴露逐漸增多(P0.05);1024μg/mL BAEB干預組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8等β-1,3-葡聚糖與幾丁質合成相關基因分別下調5.57、2.96、3.29、4.47、3.00倍;透射電鏡觀察BAEB干預后白念珠菌細胞壁的結構有破損且電子密度小,細胞壁溶解。通過酵母液泡膜染料MDY-64染色,隨著BAEB濃度的增高白念珠菌液泡膜產(chǎn)生的綠色熒光顯著減少,呈劑量依賴的特征,液泡膜破損;1024μg/mL BAEB干預組APM1、CLA4、PEP7、PEP12、PKH2、VPS15、VPS34、VPS41、YPT72等液泡合成相關基因分別下調4.410、4.534、4.070、2.184、4.506、11.435、11.316、3.192、2.372倍。結論:以上結果表明BAEB可能通過使細胞膜結構破損,細胞膜關鍵組分含量減少,進而破壞白念珠菌細胞膜的完整性從而抑制白念珠菌細胞的活性,同時可以抑制白念珠菌細胞膜麥角甾醇合成相關基因的表達,減少麥角甾醇的合成。BAEB可使白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖及幾丁質暴露從而破壞細胞壁的結構。同時可通過抑制β-1,3-葡聚糖、幾丁質生物合成相關基因的表達,進而破壞細胞壁的結構,影響白念珠菌細胞壁完整性。BAEB可損傷白念珠菌液泡膜及下調白念珠菌液泡合成相關基因。本研究為研發(fā)新型抗真菌藥物及抗真菌機制的闡明提供實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 1 .BAEB 對白念珠菌細胞活性的影響Fig 1. Effect of BAEB on activity of C.albicans3.3 BAEB 對白念珠菌細胞內(nèi)滲透壓及滲透壓相關基因的影響按照南京建成生物工程研究所甘油含量測定試劑盒說明書檢測胞量，空白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組吸光度分別0.193、0.194、0.18、0.173，依據(jù)甘油標準品標準曲線 y=0.0002x+0.066白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組胞內(nèi)甘油總量分別633.5、638.5、568.5、533.5 μmoL/L。按照碧云天蛋白檢測試劑盒方法蛋白總量，空白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組吸光1.923、1.832、1.759、1.686、1.747，依據(jù)蛋白標準品標準曲線 y=0.16

2. BAEB 對白念珠菌細胞膜胞內(nèi)滲透壓的影響及滲透壓相關基因 HOG1 和 RHR2 的表達*.P<0.05；**.P<0.01）ig 2. Effect of BAEB on intracellular osmotic pressure of C.albicans and expression of osmoticressure-associated genes HOG1 and RHR2（*.P<0.05；**.P<0.01）.4 BAEB 對白念珠菌細胞膜通透性的影響通過熒光顯微鏡觀察，白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光的強度隨著 BAEB 濃度的增加逐漸增強，空白對照組的白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光最少且最弱，1024 μg/mL BAEB白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光最多且最強。（如圖 3A1-E1）。菌株熒光圖相對應的明

BAEB對白念珠菌細胞膜通透性的影響（400×）

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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本文編號：2796993