【摘要】：細葉遠志皂苷(Tenuifolin,Ten)是從遠志中提取的主要活性成分。中藥遠志(Polygala tenuifolia)具有安神益智的功能,傳統(tǒng)上常用于提高記憶力和治療癡呆癥。有研究表明,遠志具有減少Aβ異常沉積,抑制Tau蛋白磷酸化,調節(jié)膽堿酯酶系統(tǒng)功能,減少炎性介質的產(chǎn)生,抑制谷氨酸過度釋放引起的神經(jīng)毒性,抗氧化和抑制細胞凋亡等作用,從而發(fā)揮抗AD及神經(jīng)保護作用。但Ten發(fā)揮抗AD活性的具體作用和分子機制還有待進一步闡明,尤其是Ten對Aβ產(chǎn)生及Aβ毒性作用的影響和分子機制。本論文研究了Ten通過調控細胞自噬在抗Aβ誘導的SH-SY5Y細胞損傷中的作用,探討了Ten調控自噬信號通路的分子機制,為細葉遠志皂苷應用于AD治療提供新的靶點和科學依據(jù)。具體內(nèi)容如下:1、Ten調節(jié)細胞自噬對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞形態(tài)和活力的研究:MTT法檢測細胞活力,結果顯示,50μM Ten可以改善SH-SY5Y細胞中20μM Aβ25-35誘導的細胞形態(tài)和提高Aβ25-35誘導的細胞活力,而自噬抑制劑3-MA能拮抗Ten的保護作用。結果表明Ten通過激活自噬改善了Aβ25-35誘導的細胞形態(tài)損傷和細胞活力下降。2、Ten調節(jié)細胞自噬對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激的研究:DCFH-DA熒光探針測定ROS水平,硫代巴比妥酸(TBA)測定MDA水平,WST-8法測定SOD活性,NADPH法測定GSH-Px活性,紫外線吸收法測定CAT活性,結果顯示,Ten能夠降低Aβ25-35誘導ROS和MDA濃度,并提高SOD、GSH-Px及CAT的活性,而加入自噬抑制劑3-MA會拮抗Ten的抗氧化作用。結果表明,Ten通過激活自噬減輕Aβ25-35誘導產(chǎn)生的氧化應激損傷,提高了細胞抗氧化能力。3、Ten調節(jié)細胞自噬對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞炎癥反應的研究:RT-PCR檢測IL-1β、IL-6和TNF-ɑm RNA的表達水平變化,結果顯示,Ten能降低Aβ25-35誘導的IL-1β、IL-6和TNF-ɑm RNA的表達水平,而加入3-MA會拮抗Ten的抗炎作用。結果表明,Ten通過激活自噬顯著減輕SH-SY5Y細胞中Aβ25-35誘導的炎癥損傷。4、Ten調節(jié)細胞自噬對SH-SY5Y細胞中Aβ產(chǎn)生的研究:RT-PCR檢測APP和BACE1 m RNA的表達水平變化,Elisa檢測BACE1、Aβ_(1-40)和Aβ1-42水平,結果顯示,Ten能顯著降低SH-SY5Y細胞中Aβ25-35誘導的BACE1 m RNA的表達水平和BACE1、Aβ_(1-40)和Aβ1-42的濃度,而Ten和Aβ25-35對APP m RNA的表達水平無顯著影響,加入3-MA會拮抗Ten減少Aβ產(chǎn)生的作用。結果表明,Ten通過激活自噬抑制SH-SY5Y細胞中BACE1的活性,從而減少Aβ產(chǎn)生。5、Ten對Aβ誘導細胞自噬的分子機制研究:RT-PCR和western檢測Beclin-1、LC3、m TOR、AMPK和ULK1 m RNA及蛋白水平變化,結果顯示,Aβ25-35能增加SH-SY5Y細胞中Beclin-1、LC3 m RNA和Beclin-1蛋白水平的表達,不影響LC3-II/I的值,Ten能進一步增加Aβ25-35誘導的Beclin-1和LC3的表達,而3-MA能抑制Ten誘導自噬的作用。Aβ25-35能減少SH-SY5Y細胞中AMPK和ULK1 m RNA及蛋白的表達水平,增加m TOR m RNA及蛋白的表達水平,而Ten能增加AMPK和ULK1的表達,減少m TOR的表達。結果表明,Ten可能通過調控AMPK/m TOR/ULK1通路和增加Beclin-1及LC3-II/I的表達而增強細胞自噬水平。綜上所述,Ten能抑制Aβ誘導的神經(jīng)細胞毒性,其分子機制可能是:Ten通過調控AMPK/m TOR/ULK1通路,增加Beclin-1及LC3-II/I蛋白水平激活自噬,從而降低BACE1活性和減少Aβ分泌,進而改善Aβ25-35誘導的細胞形態(tài)損傷和細胞活力下降,提高細胞抗氧化應激能力,減輕炎癥損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

Ten+Aβ+3-MA 組圖 2-1 Ten 調節(jié)細胞自2.4.2 Ten 調節(jié)細胞自噬對 Aβ誘導的細胞用 MTT 法研究 Ten 和 3-MA 對 SH與 Aβ25-35(20 μM)共同培養(yǎng) 24h，用 MTAβ(20 μM)作用于 SH-SY5Y 細胞 24h 后control)，Ten(50μM)單獨作用對細胞活胞活力，但與對照組相比無顯著性差異制劑 3-MA(10mM)共孵育 2 h，再用 Aβ力，結果顯示，Ten(50 μM)+Aβ(20μM)組

Ten 調節(jié)細胞自噬對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞活力的影響 (與對照組比較：**P<0.01；與 Aβ組比較：#P<0.05，##P<0.0細胞自噬對 Aβ誘導的 ROS 和 MDA 的影響節(jié)細胞自噬對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞中 ROS 水平 Ten 對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞中 ROS 產(chǎn)生的影響M 的 3-MA 預處理細胞 2h，再加入 20μM 的 Aβ25-35二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針預孵育 30三次后用熒光酶標儀檢測 ROS 的產(chǎn)生量。結果如圖 β能顯著增加 SH-SY5Y 細胞中 ROS 的產(chǎn)生(*P<0.05 en 能顯著減少 ROS 的產(chǎn)生(#P<0.05 vs Aβ model)，而的產(chǎn)生。結果表明，Ten 能激活自噬減少 Aβ誘導的 R

細胞自噬對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞中 ROS 水平的組比較：*P<0.05，**P<0.01；與 Aβ組比較：#P<0.05細胞自噬對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞中 MDA 水en 對 Aβ誘導的 SH-SY5Y 細胞中 MDA 產(chǎn)生的養(yǎng) 12h，用 50μM 的 Ten 和 10mM 的 3-MA 預處5-35共同作用 24h，按照 MDA 檢測試劑盒說明書與對照組相比，Aβ能顯著增加 SH-SY5Y 細胞中ntrol)，與 Aβ組相比，Ten 能顯著減少 MDA 的產(chǎn)生A 能進一步增加 MDA 的產(chǎn)生。結果表明，Ten 水平。

【參考文獻】

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本文編號：2795319