【摘要】：研究背景腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC),簡稱腎癌,是一種常見的惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的2%-3%,并以每年近2%的速度增長。隨著早期診斷技術(shù)的發(fā)展和治療手段的革新,人們對腎癌的認(rèn)識越來越多,但是目前仍然有1/3的病人初診時為晚期腎癌(metastasis RCC,mRCC)。更讓人心痛的是,仍有多于1/3的早期局灶性腎癌病人在行腎癌切除術(shù)后最終發(fā)展為進(jìn)展期腎癌。目前手術(shù)治療仍然是腎癌的首選治療方案,但是對于晚期腎癌病人由于對放化療不敏感,在已經(jīng)失去了根治性手術(shù)機(jī)會的時候,減瘤手術(shù)聯(lián)合靶向治療藥物或許可以延長預(yù)后。盡管對腎癌的認(rèn)識越來越全面、治療腎癌的手段越來越多,腎癌的預(yù)后仍然不容樂觀,總中位生存時間少于1年。嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)急迫的需要我們加強(qiáng)對腎癌發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制以及相關(guān)信號通路的理解,以期發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。蟾毒靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥的有效成分之一,目前已被多項研究證實(shí)對肺癌、肝癌、前列腺癌和宮頸癌等有抗腫瘤作用。上述研究提示蟾毒靈是一個潛在的腫瘤靶向治療的有意義靶點(diǎn)。但是關(guān)于蟾毒靈對腎細(xì)胞癌的作用未見相關(guān)研究。在本研究中,我們試圖闡述蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞的作用及潛在的機(jī)制。目的探討蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響并探索其可能的作用機(jī)制;為腎癌的治療尋找新的方法和思路。方法1.蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞株的作用1.1.CCK-8法檢測蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞的增殖能力的作用1.2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞集落形成能力的作用1.3.流式細(xì)胞儀檢測蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞周期及凋亡進(jìn)程的作用1.4.劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響2.蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞株作用機(jī)制研究2.1.PCR分析在蟾毒靈處理前后ACHN細(xì)胞內(nèi)AKT、E-cadherin和N-cadherin基因表達(dá)量的變化2.2.IF細(xì)胞免疫熒光法明確E-cadherin蛋白在蟾毒靈處理前后ACHN細(xì)胞內(nèi)表達(dá)位置的改變和表達(dá)量的變化2.3.Western blot分析在蟾毒靈處理前后ACHN細(xì)胞內(nèi)周期蛋白、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變結(jié)果1.蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞株的作用1.1.蟾毒靈明顯抑制ACHN細(xì)胞增殖,12h、24h、48h和72h對應(yīng)的IC50分別為 228.08±9.64,29.41 ±2.60,10.49±0.79,6.7±0.97nM。1.2.蟾毒靈明顯抑制ACHN細(xì)胞集落形成能力,和對照組相比隨著蟾毒靈濃度的增加,克隆形成數(shù)從233.00 ± 12.12個減少到183.67 ± 5.69,94.33 ± 5.86和65.33±4.51個p0.05),而且隨著濃度增加,克隆形成的范圍越來越小。1.3.蟾毒靈阻滯ACHN于G2/M期,但無明顯促凋亡作用。在不同濃度蟾毒靈(0、5、10、20nM)處理24h后,處于G2/M期的細(xì)胞從7.86±0.96%顯著增加到了15.49±3.51%,23.38±2.98%和 37.07±7.05%(p0.05)。1.4.蟾毒靈明顯抑制ACHN細(xì)胞遷移、侵襲能力,隨著蟾毒靈濃度的增加,ACHN細(xì)胞劃痕遷移率、Transwell遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)都明顯下降(p0.01)。2.蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞作用機(jī)制研究2.1.QT-PCR結(jié)果顯示E-cadherin基因的表達(dá)水平在20nM蟾毒靈作用24h后的ACHN內(nèi)顯著升高,而N-cadherin則顯著下降;但是Akt基因的表達(dá)量無顯著變化。2.2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示E-cadherin蛋白在20nM蟾毒靈作用24h后的ACHN細(xì)胞膜上表達(dá)量明顯增加。2.3.在蟾毒靈作用24h后,Western blot提示ACHN細(xì)胞內(nèi)CDK1、Cyclin B1表達(dá)量明顯下降(p0.05),p21明顯上升(p0.05;E-cadherin明顯上升(p0.05),N-cadherin 和 HIF-1α 明顯下降(p0.05);PI3K、p-Akt 和 p-mTOR 明顯下降(p0.05),t-Akt 無明顯變化(p0.05)。結(jié)論1.蟾毒靈對腎癌ACHN細(xì)胞有生長抑制作用。2.蟾毒靈阻滯腎癌ACHN細(xì)胞周期于G2/M期,抑制ACHN細(xì)胞集落形成、遷移和侵襲。3.蟾毒靈可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

如圖３邋Ｂ在不同濃度蟾毒靈（０、５、１０、２０ｎＭ）處理２４ｈ后，處于Ｇ２／Ｍ逡逑期的細(xì)胞從邋７．８６±０．９６％邋顯著增加到了邋１５．４９±３．５１％，２３．３８±２．９８°／0邋和逡逑３７．０７±７．０５％邋（ｐ＜０．０５）。而相同濃度作用相同時間后，如圖１－３Ｃ所示流式逡逑細(xì)胞儀檢測ＡＣＨＮ凋亡細(xì)胞數(shù)相對于對照組無明顯增加（ｐ＞０．０５）。同時我逡逑們增加蟾毒靈濃度和時間后，ＡＣＨＮ細(xì)胞處于早期凋亡細(xì)胞數(shù)仍無明顯增加，逡逑而處于晚期凋亡即ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ和ＰＩ均為陽性的細(xì)胞明顯增加。Ａｎｎｅｘｉｎ逡逑Ｖ邋ＦＩＴＣ和ＰＩ均為陽性的細(xì)胞可能為凋亡細(xì)胞，也可能為各種因素導(dǎo)致的死逡逑亡細(xì)胞

２．５．蟾毒抑制腎癌ＡＣＨＮ細(xì)胞遷移、侵襲能力逡逑在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，不同濃度蟾毒靈（０、１０、２０ｎＭ）處理ＡＣＨＮ細(xì)胞逡逑２４ｈ后，ＡＣＨＮ細(xì)胞劃痕遷移率如圖１－４邋Ａ、Ｂ從７８．６０±３．３８％下降到逡逑５２．７５±２．５５％和邋１２．３６±０．８７％邋（ｐ＜０．０５）。而在邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，逡逑不同濃度蟾毒靈（０、１０、２０ｎＭ）作用于ＡＣＨＮ細(xì)胞后，如圖１－４邋Ｃ、Ｄ所逡逑示無基質(zhì)膠的小室中下室的細(xì)胞數(shù)從２８４．６７±１４．５７下降到１５４．００７．９４±和逡逑４４．６７±２．０８邋（ｐ＜０．０５）；有基質(zhì)膠的小室中下室的細(xì)胞數(shù)從１６４．３３士１４．５７下降逡逑１７逡逑

邐ｌＯｎＭ邐２０ｎＭ逡逑圖１－３．蟾毒靈阻滯ＡＣＨＮ細(xì)胞于Ｇ２／Ｍ期逡逑Ａ：不同濃度蟾毒靈作用２４ｈ后ＡＣＨＮ細(xì)胞處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)；Ｂ：隨著濃度增逡逑力口，處于Ｇ２／Ｍ期的細(xì)胞數(shù)明顯增加（＊ｐ＜０．０５，邋Ｎ＝３）；邋Ｃ：不同濃度蟾毒靈作用２４ｈ逡逑后，流式細(xì)胞儀檢測到的凋亡ＡＣＨＮ細(xì)胞數(shù)無明顯增多。逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ａｒｒｅｓｔ邋ａｔ邋Ｇ２／Ｍ邋ｉｎ邋ＡＣＨＮ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：邋Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｈａｓｅｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．邋Ｂ：邋Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋Ｇ２／Ｍ邋ｐｈａｓｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ邋（＊Ｐ邋＜逡逑０．０５，邋Ｎ＝３）．邋Ｃ：Ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋ｆｏｒ邋２４ｈ，邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｉｄｎｏｔ邋ｉｎｃｒｅａｓｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．逡逑２．５．蟾毒抑制腎癌ＡＣＨＮ細(xì)胞遷移、侵襲能力逡逑在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，不同濃度蟾毒靈（０、１０、２０ｎＭ）處理ＡＣＨＮ細(xì)胞逡逑２４ｈ后，ＡＣＨＮ細(xì)胞劃痕遷移率如圖１－４邋Ａ、Ｂ從７８．６０±３．３８％下降到逡逑５２．７５±２．５５％和邋１２．３６±０．８７％邋（ｐ＜０．０５）。而在邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，逡逑不同濃度蟾毒靈（０、１０、２０ｎＭ）作用于ＡＣＨＮ細(xì)胞后

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2795289