【摘要】：目的該課題是利用小鼠膽管結(jié)扎(BDL)模型探討脫水穿心蓮內(nèi)酯(DA)對小鼠膽汁淤積誘導的肝纖維化的保護作用;同時,通過體外培養(yǎng)人LX-2細胞探討DA在肝纖維化過程中的作用機制。方法動物實驗:40只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為4組:羥甲基纖維素(CMC)+假手術(shù)(sham)組、DA+sham組、CMC+BDL組和DA+BDL組,每組10只小鼠。BDL組小鼠進行膽總管雙重結(jié)扎并中間離斷,sham組小鼠進行假手術(shù),膽總管只穿線不結(jié)扎。DA+sham組和DA+BDL組小鼠給予DA灌胃(100mg/kg)給藥,每日一次,同時CMC+sham組和CMC+BDL組小鼠給予灌服相同劑量的CMC。連續(xù)灌胃5d后各組小鼠進行相應(yīng)的手術(shù),術(shù)后12h繼續(xù)灌胃給予每只小鼠相應(yīng)組別的藥物治療。連續(xù)7d后處死小鼠收集血清和肝臟標本,做以下檢測:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和總膽汁酸(TBA)試劑盒檢測血清中ALT、TBIL和TBA濃度;小鼠肝臟石蠟切片HE染色,鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化,天狼猩紅染色觀察肝纖維化程度;采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測肝組織中肝纖維化相關(guān)基因的相對表達量,包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、I型膠原α1(Col1a1)mRNA表達;Western blot檢測肝組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的相對表達量。體外細胞實驗:體外培養(yǎng)人LX-2細胞,使用TGF-β激活LX-2細胞。分為空白溶劑(DMSO)對照組、DA組(20μM/L)、TGF-β組(2ng/ml)、低劑量DA(5μM/L)+TGF-β(2ng/ml)組、中劑量DA(10μM/L)+TGF-β(2ng/ml)組和高劑量DA(20μM/L)+TGF-β(2ng/ml)組。qRT-PCR檢測各組細胞中Col1a1mRNA相對表達量。Western blot檢測各組細胞中α-SMA的蛋白相對表達量。結(jié)果動物實驗:在小鼠實驗中,我們發(fā)現(xiàn)CMC+BDL組小鼠血清中ALT、TBIL和TBA的水平顯著上升(P0.01),但給予DA后,這些生化指標的水平顯著降低(P0.01),肝損傷明顯減輕;肝臟形態(tài)學分析顯示,HE染色可見,與CMC+sham組相比,CMC+BDL組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝索斷裂,在匯管區(qū)有大量的炎性細胞的浸潤,膽管壁明顯增厚,并出現(xiàn)明顯的增生,有大量的彌漫性、點狀樣肝細胞壞死灶;與CMC+BDL組相比,DA+BDL組小鼠病理損傷明顯改善,炎性細胞浸潤明顯減少,壞死灶明顯減少。天狼猩紅染色結(jié)果顯示,與CMC+sham組相比,CMC+BDL組小鼠肝組織中匯管區(qū)周圍出現(xiàn)大量膠原纖維沉積;與CMC+BDL組相比,DA+BDL組小鼠肝組織匯管區(qū)周圍膠原纖維沉積明顯減少,纖維程度減輕(P0.01)。同時qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與CMC+sham組比較,CMC+BDL組小鼠肝組織中TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表達水平升高;DA明顯降低了小鼠肝組織中BDL誘導的TGF-β、Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白表達水平的升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)。體外細胞實驗:qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示DA治療能夠顯著抑制TGF-β激活的人LX-2細胞中Col1a1 mRNA和α-SMA蛋白的表達(P0.05或P0.01)。結(jié)論DA對BDL誘導的小鼠肝損傷具有保護作用;DA可能通過抑制纖維化相關(guān)因子的表達,進而減少肝星狀細胞(HSC)的活化,達到抗纖維化的作用。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

DA化學結(jié)構(gòu)式

15圖 2 各組小鼠血清 ALT、TBIL、TBA 水平注：A- ALT 水平；B- TBIL 水平；C- TBA 水平；*P<0.05，**P<0.01。

二、 DA 對膽管結(jié)扎誘導的小鼠肝臟組織病理學的影響HE 結(jié)果顯示：CMC+sham 組和 DA+sham 組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝實質(zhì)內(nèi)偶見少量的炎性細胞，無膽管的增生。CMC+BDL 組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索斷裂，在匯管區(qū)有大量的炎性細胞的浸潤，膽管壁明顯增厚，并出現(xiàn)明顯的增生，有大量的彌漫性、點狀樣肝細胞壞死灶。與 CMC+BDL 組相比，DA+BDL 組小鼠病理損傷明顯改善，炎性細胞浸潤顯著減少，膽汁淤積性肝細胞壞死灶的面積明顯減少（圖 3）。天狼猩紅染色結(jié)果顯示：CMC+sham 組和 DA+sham 組小鼠，僅見少量染成紅色的膠原纖維圍繞在膽管和一些大的靜脈周圍。CMC+BDL 組小鼠肝組織中匯管區(qū)周圍膠原纖維大量沉積。對比 CMC+BDL 組，DA+BDL 組小鼠肝組織內(nèi)匯管區(qū)周圍膠原纖維沉積明顯減少，纖維程度減輕（圖 4）。

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本文編號：2792815