【摘要】：第一部分超促排卵小鼠模型的建立以及超促排卵對(duì)小鼠子代青春期與動(dòng)情周期的影響目的:建立超促排卵(COH)小鼠模型,并利用該模型研究超促排卵對(duì)小鼠子代青春期與動(dòng)情周期的影響。方法:將40只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為兩組,COH組采用7.5 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)和7.5 IU人絨毛膜促性腺激素(HCG)對(duì)動(dòng)情周期穩(wěn)定的雌性小鼠進(jìn)行超促排卵,以獲得第一代的雌性子代小鼠。正常組在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量的生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照,于動(dòng)情期與雄鼠合籠以獲取子代小鼠。待雌性子代小鼠斷奶后,篩選體質(zhì)指數(shù)(BMI)相近的各組小鼠觀察其陰門(mén)開(kāi)放和第一次動(dòng)情周期出現(xiàn)的時(shí)間,并檢測(cè)28日齡雌性子代小鼠血清中E_2,AMH,FSH和LH的水平,以及卵巢中Esr1,Amhr2,Fshr和Lhcgr的mRNA表達(dá),并且進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)和卵巢組織形態(tài)學(xué)的觀察。我們還通過(guò)TUNEL方法研究了卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡,運(yùn)用Real-time qPCR檢測(cè)卵巢中Fas,FasL,Bax,Bcl2和Caspase 3,8,9的mRNA表達(dá);并采用Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase 3,8,9的蛋白質(zhì)表達(dá)。此外,我們進(jìn)一步觀察了雌性子代成年小鼠動(dòng)情周期的規(guī)律性,進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)并測(cè)量血清和卵巢中的AMH的水平。結(jié)果:與自然妊娠相比較,COH導(dǎo)致小鼠不良的妊娠結(jié)局,表現(xiàn)為妊娠期時(shí)間延長(zhǎng),并伴有大量死胎,妊娠丟失率升高。與正常組的雌性子代小鼠進(jìn)行對(duì)比,COH組的雌性子代小鼠第一次動(dòng)情周期出現(xiàn)的時(shí)間延遲,卵泡計(jì)數(shù)顯示其具有更多的閉鎖卵泡,并伴有更明顯的卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡,卵巢中顆粒細(xì)胞相關(guān)凋亡因子如:FasL,Bax,Caspase3,8,9的mRNA水平顯著增加,Cleaved-caspase 8的蛋白質(zhì)水平顯著上升。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),28日齡的COH組雌性子代小鼠的血清LH和E_2水平顯著低于正常組雌性子代小鼠,并且其卵巢中相應(yīng)激素受體Amhr2,Fshr,Lhcgr和Esr1的mRNA水平全部顯著下調(diào)。此外,我們持續(xù)觀察了兩組雌性子代小鼠成年之后(56日齡)的動(dòng)情周期規(guī)律性,盡管動(dòng)情周期的平均天數(shù)相差無(wú)幾,與正常組相比,COH組雌性子代小鼠的動(dòng)情期相對(duì)延長(zhǎng),而動(dòng)情前期相對(duì)縮短。卵泡計(jì)數(shù)顯示COH組56日齡的雌性子代小鼠的始基卵泡和初級(jí)卵泡的數(shù)目顯著減少,而其血清和卵巢中的AMH水平顯著升高。結(jié)論:COH可導(dǎo)致母體不良的妊娠結(jié)局,并對(duì)小鼠雌性子代的卵泡發(fā)育產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致雌性子代小鼠的青春期轉(zhuǎn)化延遲以及隨后成年期的動(dòng)情周期紊亂。其機(jī)制可能與激素分泌失調(diào),卵泡顆粒細(xì)胞凋亡增加,卵巢相關(guān)激素受體的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。第二部分補(bǔ)腎活血方改善超促排卵小鼠模型早期妊娠丟失的療效評(píng)估及其機(jī)制研究目的:觀察補(bǔ)腎活血方改善超促排卵小鼠模型早期妊娠丟失的療效并探索其潛在的作用機(jī)制。方法:將200只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為四組:對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、補(bǔ)腎活血方正常劑量組(BSHXR1)和補(bǔ)腎活血方低劑量組(BSHXR2)。模型組和中藥組的雌性小鼠采用7.5IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)和7.5IU人絨毛膜促性腺激素(HCG)進(jìn)行超促排卵(COH)后與雄鼠以1:1的比例合籠。正常對(duì)照組在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量的生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照并于動(dòng)情期與雄鼠以1:1的比例合籠。各組合籠小鼠于次日早晨8點(diǎn)檢查陰栓,見(jiàn)栓日認(rèn)為是妊娠的第1天。從妊娠的第一天(D1)開(kāi)始,對(duì)照組和模型組的見(jiàn)栓小鼠每天給予0.3ml生理鹽水灌胃,而B(niǎo)SHXR1和BSHXR2組,分別給予0.3ml的正常劑量和低劑量的補(bǔ)腎活血溶液灌胃。一部分孕鼠于妊娠D5、D6和D8處死以獲取血清、卵巢和子宮標(biāo)本,一部分孕鼠單籠飼養(yǎng)以觀測(cè)其妊娠結(jié)局。利用放射免疫的方法測(cè)定血清中雌、孕激素的含量,并通過(guò)免疫組化染色觀察各組卵巢和子宮的形態(tài),蛻膜血管的形成,子宮中激素受體ERα,PR以及血管生成因子VEGFA,ANGPT2和FGF2的表達(dá),并利用Real-time q PCR和Western blot的方法分別檢測(cè)子宮中相關(guān)因子的m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果:與對(duì)照組相比較,COH小鼠著床后的胚胎丟失率顯著增加,并出現(xiàn)了大量死胎,伴有妊娠期的顯著延長(zhǎng),而補(bǔ)腎活血方能夠減少胚胎丟失,維持孕早期胚胎的存活。COH過(guò)度刺激卵巢使其體積與重量均顯著增加,血清中雌、孕激素的含量大幅上升,子宮蛻膜化受損,子宮中相關(guān)激素受體ERα,PR的表達(dá)下調(diào),然而補(bǔ)腎活血方能夠通過(guò)改善卵巢的過(guò)度刺激狀態(tài),控制雌、孕激素的過(guò)度分泌,上調(diào)子宮上皮和基質(zhì)中激素受體ERα,PR的表達(dá),促進(jìn)妊娠的順利進(jìn)行。此外,補(bǔ)腎活血方能夠通過(guò)上調(diào)子宮蛻膜血管竇FGF2的表達(dá),增加蛻膜血管的密度并有利于血管的發(fā)育與成熟,進(jìn)而為胚胎提供足夠的血液供應(yīng)及支持后續(xù)胎盤(pán)的形成。結(jié)論:COH可導(dǎo)致卵巢過(guò)度刺激的狀態(tài),引起雌、孕激素及其子宮中相應(yīng)受體的協(xié)調(diào)運(yùn)作發(fā)生紊亂,同時(shí)損害了蛻膜血管的發(fā)育與成熟,導(dǎo)致母體不良的妊娠結(jié)局,而補(bǔ)腎活血方能夠有效降低著床后的胚胎丟失率,促進(jìn)妊娠的建立與維持,其機(jī)制可能與降低過(guò)度分泌的雌、孕激素,增強(qiáng)上皮和基質(zhì)中激素受體ERα,PR的表達(dá),上調(diào)子宮蛻膜血管竇FGF2的表達(dá)水平有關(guān)。由此可見(jiàn),我們的研究為補(bǔ)腎活血方治療早期妊娠丟失的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的證據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R285.5
【圖文】：

圖 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述。妊娠第五天記錄小鼠的著床位點(diǎn)。篩選 1 日齡，21 日齡，28 日齡和 56 日齡的子代雌性小鼠用于各項(xiàng)指標(biāo)的觀測(cè)與分析，并提供各項(xiàng)指標(biāo)的每組樣本數(shù)目。

代小鼠出現(xiàn)第一次動(dòng)情周期的時(shí)間顯著晚于正常雌性子代小鼠(P<0.05)（見(jiàn)圖2B）。并且，COH組的雌性子代小鼠第一次陰門(mén)開(kāi)與第一次動(dòng)情周期出現(xiàn)之間的時(shí)間差顯著長(zhǎng)于正常雌性子代小鼠(P<0.01)（見(jiàn)圖2C）。圖2 COH組的雌性子代小鼠顯示出第一次動(dòng)情周期延遲。（A）比較兩組雌性子代小鼠第一次陰門(mén)開(kāi)的時(shí)間，n=18。（B）比較兩組雌性子代小鼠第一次動(dòng)情周期出現(xiàn)的時(shí)間，n=9 11。（C）比較兩組第一次陰門(mén)開(kāi)與第一次動(dòng)情周期出現(xiàn)之間的時(shí)間差，n=9 11。與正常組相比：*P < 0.05，**P < 0.01。為了進(jìn)一步探索COH雌性子代小鼠第一次動(dòng)情周期延遲的原因，我們分析了出現(xiàn)動(dòng)情周期之前的D28日齡子代小鼠的卵泡生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示COH組的雌性子代小鼠的閉2.COH對(duì)雌性子代青春期轉(zhuǎn)化的影響

圖3 28日齡的COH雌性子代小鼠顯示出更多的閉鎖卵泡。（A）比較兩組間各階段卵泡的百分比。n=6, 與正常組相比，*P <0.05。PDF,始基卵泡; PMF,初級(jí)卵泡; SEF,次級(jí)卵泡; TEF,竇狀卵泡; ATF,閉鎖卵泡; TF,總卵泡。（B）正常組雌性子代小鼠卵巢的代表性圖片，bar = 200 μm.（C）COH組雌性子代小鼠卵巢的代表性圖片，bar = 200 μm。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2789926