【摘要】：急性應(yīng)激反應(yīng)是由劇烈的精神刺激或持續(xù)困境的作用下引發(fā)的應(yīng)激障礙,其常表現(xiàn)在患者的心理和生理層面。目前對于此類病癥的常用治療手段常以心理干預(yù)治療為主,但這種治療并不能解決應(yīng)激所導(dǎo)致的身體疾病問題且無法起到預(yù)防保護作用。鑒于青春期情緒急劇變化的青少年的心理疾病和處于壓力狀態(tài)下的中老年人群,由于急性應(yīng)激導(dǎo)致的亞健康問題和疾病如失眠、不同程度的抑郁、情感障礙和精神分裂等疾病的逐漸高發(fā)已成為不容忽視的危害人民健康的重大問題,發(fā)現(xiàn)情感障礙應(yīng)激的原因,對其進行盡早干預(yù)和治療,尋找出高效低毒的抗應(yīng)激新藥顯得極為重要。大麻二酚提取自植物大麻,其具有一定的抗焦慮抗應(yīng)激作用,但是長期連續(xù)使用卻沒有大麻致幻成癮的毒副作用,因此將大麻二酚應(yīng)用于抗應(yīng)激藥物及保健品的研發(fā)上具有重要的開發(fā)前景。本課題組在前期研究中,通過低溫水浸束縛大鼠應(yīng)激模型,研究發(fā)現(xiàn)造模成功后的急性應(yīng)激大鼠肺臟出現(xiàn)明顯水腫炎癥、變性和壞死等損傷。研究大麻二酚對應(yīng)激所致肺損傷的藥理學(xué)效應(yīng)并闡明其作用機制,為開發(fā)新型抗應(yīng)激性肺損傷新藥和功能性食品奠定理論基礎(chǔ)。本文通過以下幾個方面對大麻二酚的抗應(yīng)激作用及其機制進行研究:第一部分:本文通過低溫(20℃)水浸束縛建立急性應(yīng)激大鼠肺損傷模型并將成功建模的急性應(yīng)激大鼠隨機分為如下幾組:空白對照組、模型組、大麻二酚灌胃組高(108mg/kg)、中(36mg/kg)、低(12mg/kg)劑量組,以探討大麻二酚的抗急性應(yīng)激性肺損傷的藥理學(xué)效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)模型組中的動物肺組織臟器系數(shù)、濕重/干重比(W/D)均高于空白組(p0.01);而與模型組相比較,大麻二酚中、高劑量組肺臟器系數(shù)和W/D值均顯著降低并呈劑量依賴性,說明中劑量(36 mg/kg)灌胃大麻二酚即可表現(xiàn)出一定程度的對抗肺水腫等急性損傷作用。(2)利用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中皮質(zhì)酮(CORT)、TNF-α和IL-1β等細胞因子的水平,結(jié)果顯示,模型組動物血清中CORT、TNF-α和IL-1β水平相比空白組均有顯著升高(p0.01),而大麻二酚中、高劑量組動物血清中的CORT、TNF-α和IL-1β水平均比模型組動物血清中的相應(yīng)指標呈現(xiàn)顯著下降(P0.05),說明急性應(yīng)激發(fā)生時能促使機體大量炎癥細胞因子的產(chǎn)生和釋放,而大麻二酚則通過抑制體內(nèi)炎性細胞因子的釋放而產(chǎn)生抗應(yīng)激作用。(3)進行病理組織學(xué)檢測,HE染色結(jié)果顯示,模型組中動物的肺組織水腫、肺泡壁顯著增厚,肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形坍塌并伴有大量炎細胞浸潤,而大麻二酚各劑量組均呈劑量依賴性抑制肺組織炎細胞浸潤及肺泡結(jié)構(gòu)變化,并抑制纖維化等重構(gòu)的病理學(xué)特征的發(fā)生。通過組織學(xué)HE染色和細胞因子檢測等指標,證明急性應(yīng)激大鼠肺組織損傷動物模型的成功建立,提示中、高劑量的大麻二酚能抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生和急性肺水腫、炎性性變和組織結(jié)構(gòu)的破壞等病理樣變,為防治慢性阻塞性肺病(COPD)提供了科學(xué)依據(jù)。第二部分:本課題組通過第一部分實驗發(fā)現(xiàn)大麻二酚具有顯著的抗急性應(yīng)激大鼠肺部損傷的藥理學(xué)效應(yīng),本部分內(nèi)容通過體外實驗方面系統(tǒng)研究其抗急性應(yīng)激大鼠肺部損傷的藥理作用機制:首先建立TBHP(叔丁基過氧化氫)誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞A549氧化應(yīng)激損傷模型,并設(shè)置空白組、模型組和大麻二酚高、中、低劑量組,進行以下體外細胞實驗:(1)通過MTT 比色法確定符合細胞造模要求的TBHP濃度(200 μmol/L)和大麻二酚的無毒劑量并按分組進行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對模型組55.3%的細胞存活率,大麻二酚能呈劑量依賴性對TBHP所誘導(dǎo)的細胞損傷起到干預(yù)保護作用,其細胞存活率分別為:60.5%(1.25μmol/L)、73.4%(2.5μmol/L)和82.2%(5μmol/L)。(2)在確認大麻二酚對TBHP誘導(dǎo)細胞損傷的抗氧化應(yīng)激作用后對其抗凋亡機制進行系統(tǒng)性研究。利用Hoechst33258染色法定性觀察藥物以濃度依賴性發(fā)揮抗凋亡作用,細胞核染色結(jié)果顯示5 μmol/L的大麻二酚能起到明顯保護作用。(3)采用流式細胞術(shù)進行定量分析,通過Annexin V/PI雙染法和DCFH-DA染色檢測各組細胞的凋亡情況和活性氧生成率。結(jié)果顯示5 μmol/L大麻二酚能顯著降低TBHP誘導(dǎo)細胞內(nèi)活性氧水平,且其12.88%的凋亡率相比模型組34.5%凋亡率具有顯著降低。這提示大麻二酚可能是通過降低TBHP引起的高活性氧水平起到抗凋亡作用。第三部分:為進一步探索大麻二酚抗急性應(yīng)激大鼠肺部損傷的分子藥理學(xué)機制,本課題組先通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)結(jié)合基因差異分析和KEGG功能富集分析的結(jié)果,篩選出應(yīng)激大鼠體內(nèi)基因異常表達的靶標基因p38MAPK,再采用蛋白免疫印跡法檢測p38MAPK蛋白及其下游凋亡相關(guān)蛋白的表達:(1)細胞水平分子機制研究,采用Western Blot法檢測細胞p38MAPK通路的激活程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大麻二酚能通過抑p-p38MAPK、Bax和Cleaved-Caspase3的表達水平并上調(diào)Bcl-2蛋白表達水平產(chǎn)生抗凋亡作用。(2)動物體內(nèi)水平分子機制研究,采用Western Blot檢測大鼠急性應(yīng)激肺組織中關(guān)鍵蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量組大麻二酚能對抗急性應(yīng)激導(dǎo)致p38MAPK信號通路的激活,并能顯著下調(diào)下游Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表達以及提高Bcl-2蛋白水平,由此產(chǎn)生對急性應(yīng)激大鼠肺損傷的保護作用。綜上所述,大麻二酚對急性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠肺部損傷有保護作用,其保護機制與抑制p38MAPK應(yīng)激通路的激活,下調(diào)Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表達,進而減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。提示大麻二酚在對抗應(yīng)激相關(guān)疾病中具有較好的保護作用,并為開發(fā)新型抗急性肺應(yīng)激性損傷新藥和功能性食品提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

．邋ＭＴＴ檢測ＴＢＨＰ對Ａ５４９的毒性作用；ｂ．邋ＭＴＴ檢測ＣＢＤ對Ａ５４９細胞的毒性作用；ｃ．邋ＣＢＤ對Ｔ誘導(dǎo)Ａ５４９細胞氧化損傷的保護作用逡逑圖３－１邋ＭＴＴ檢測不同劑量的ＣＢＤ和ＴＢＨＰ對Ａ５４９細胞活性的影響逡逑ＭＴＴ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｏｘｉｃ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＴＢＨＰ邋ｏｎ邋Ａ５４９邋；邋ｂ．邋Ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ＣＢＤ邋ｔｏ邋Ａ５４９邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＭＴＴ邋ａｓｓａＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＣＢＤ邋ｏｎ邋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｄａｍａｇｅ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＴＢＨＰ邋ｉｎ邋Ａ５４９邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋：邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｏｓｅｓ邋ｏｆ邋ＣＢＤ邋ａｎｄ邋ＴＢＨＰ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋Ａ５４９邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＭＴＴ邋ａｓ２９逡逑

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文逡逑３．３．２邋ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８染色法檢測ＣＢＤ對ＴＢＨＰ誘導(dǎo)Ａ５４９細胞凋亡的保護作用逡逑于熒光倒置顯微鏡下避光觀察染色完成的１２孔板，如圖３－２可見，空白組細胞染逡逑色后形態(tài)正常均一，呈均勻淡藍色熒光且折光性良好。而經(jīng)ＴＢＨＰ處理后，模型組細逡逑胞可見細胞大小不均一，因部分凋亡細胞在染色過程中脫落導(dǎo)致細胞間空隙增大，并逡逑且出現(xiàn)因細胞凋亡所致出現(xiàn)亮藍色明顯的“凋亡小體”。而當使用１．２５邋ｐｍｏｌ／Ｌ、２．５逡逑Ｍｍｏｌ／、５邋Ｍｍｏｌ／Ｌ大麻二酚藥物干預(yù)后，其凋亡小體數(shù)量減少，且減少程度呈劑量依逡逑賴性。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑■邋■逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑■逡逑Ｅ逡逑Ａ．空白組；Ｂ．模型組；Ｃ．ＣＢＤ低劑量組；Ｄ．ＣＢＤ中劑量組；Ｅ．ＣＢＤ氋劑量組逡逑圖３－２各組細胞Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色結(jié)果逡逑３０逡逑

３．３．３邋ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ雙染法檢測細胞凋亡逡逑使用ＦｌｏｗＪｏ邋Ｖ１０處理，將四個象限的左下象限細胞群比例作為正常細胞率；將逡逑右上及右下象限并為細胞凋亡率，以此統(tǒng)計結(jié)果作圖３－３。實驗結(jié)果可見表３－１所示，逡逑模型組細胞凋亡率達到３４邋％以上，與空白組６％的凋亡率相比具有明顯差異。而逡逑ＣＢＤ的給藥則可逆轉(zhuǎn)此過程，并且呈劑量依賴性。當ＣＢＤ的劑量達到５邋ｎｍｏｌ／Ｌ時其逡逑細胞凋亡率相比模型組顯著降低，為１３邋％，由此可見大麻二酚能夠顯著預(yù)防ＴＢＨＰ逡逑所誘導(dǎo)的細胞凋亡作用。逡逑表３－１不同濃度ＣＢＤ對ＴＢＨＰ誘導(dǎo)Ａ５４９細胞凋亡率的影響（ｎ＝３，邋Ｓ±ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１：邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＣＢＤ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋Ａ５４９邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ逡逑ＴＢＨＰ邋（ｎ＝３，邋ｘ±ｓ）逡逑組別邐濃度（Ｍｍｏｌ／Ｌ）邐正常細胞率（％）邐總凋亡率（％）逡逑空白對照組邐０邐９３．３±０．３５＊＊邐６．３７±０．１６＊＊逡逑模型組邐２００邋（ＴＢＨＰ）邐６４．６±０．２８邐３４．５１±０．２２逡逑ＣＢＤ邋低劑量組邐１．２５邐（ＣＢＤ）邐７７．１±０．３３＊＊邐２３．４３±０．７９＊＊逡逑ＣＢＤ邋中劑量組邐２．５邐（ＣＢＤ）邐８１．８±０．３１＊＊邐１７．４８±０．２７＊＊逡逑ＣＢＤ邋高劑量組邐５邐（ＣＢＤ）邐８８．６９±０．２１＊＊邐１２．８８±０．３１＊＊逡逑注：與模型組比較：＊尸＜邋０．０５邋

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本文編號：2789853