發(fā)布時(shí)間：2020-08-11 10:51

【摘要】：背景目的:以往研究證實(shí)肝纖維是可逆的,而目前尚缺少逆轉(zhuǎn)肝纖維化特效又安全的藥物。本研究通過復(fù)制血瘀型肝纖維化大鼠模型,觀察莪術(shù)醇對血瘀型肝纖維化大鼠的治療效果,并明晰莪術(shù)醇對體內(nèi)外肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)超微結(jié)構(gòu)的影響,探討莪術(shù)醇抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法:(1)血瘀證肝纖維化大鼠模型的復(fù)制及大鼠原代LSEC的分離、培養(yǎng)及鑒定:(1)血瘀證肝纖維化大鼠模型的復(fù)制:“去甲腎上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”復(fù)制血瘀型肝纖維化大鼠模型。前3周以40%CCl4花生油混合液,0.3 mL/100g劑量,皮下注射給大鼠,每周2次,第4周開始以50%CCl4花生油混合液同樣方法予大鼠,共8周。從第2周開始,予大鼠尾靜脈注射0.1 g/L去甲腎上腺素,1次/日,連續(xù)給藥3周。并于模型復(fù)制開始的第1天及第10天,予大鼠尾靜脈注射50 g/L小牛血清白蛋白。外加10%乙醇予大鼠灌胃。通過自擬血瘀證證候評分表觀察血瘀證復(fù)制情況,HE染色和Masson染色觀察肝組織纖維化病變,全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清肝功能及肝纖維化四項(xiàng)(HA、LN、PⅢNP、Col-Ⅳ)水平,綜合觀察模型復(fù)制情況。(2)大鼠原代LSEC的分離、培養(yǎng)及鑒定:通過肝臟膠原酶灌注結(jié)合Percoll密度梯度沉降法及細(xì)胞選擇性貼壁法,分離LSEC。掃描電鏡及di-Ac-LDL免疫熒光染色,鑒定分離培養(yǎng)的LSEC。(2)莪術(shù)醇治療血瘀證肝纖維化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究:實(shí)驗(yàn)分為6組,即正常對照組、血瘀型肝纖維化模型組、秋水仙堿組、丹參酚酸B組、莪術(shù)醇低劑量組、莪術(shù)醇高劑量組。采用“去甲腎上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”復(fù)制血瘀型肝纖維化大鼠模型成功后,予各藥物治療,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定ET-1蛋白的表達(dá),掃描電鏡及透射電鏡觀察肝組織LSEC超微結(jié)構(gòu)改變,并測定肝指數(shù)、血瘀證證候積分、病理檢查(HE染色和Masson染色)、血清肝功能及肝纖維化四項(xiàng)水平,明晰莪術(shù)醇對血瘀型肝纖維化的作用。(3)莪術(shù)醇改善LSEC超微結(jié)構(gòu)病變的體外實(shí)驗(yàn)研究:通過瘦素誘導(dǎo)激活LSEC后,予不同濃度的莪術(shù)醇治療,掃描電鏡及透射電鏡觀察LSEC超微結(jié)構(gòu)變化,了解莪術(shù)醇對瘦素誘導(dǎo)激活的LSEC的影響。結(jié)果:(1)血瘀證肝纖維化大鼠模型的復(fù)制及大鼠原代LSEC的分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果:(1)血瘀證肝纖維化大鼠模型的復(fù)制結(jié)果顯示,采用“去甲腎上腺素+小牛血清白蛋白+乙醇+四氯化碳”復(fù)制的血瘀證肝纖維化大鼠模型大鼠毛發(fā)稀疏、枯燥,舌面暗紅,甚至青紫有瘀斑,舌底靜脈曲張,尾部有瘀斑,血瘀證證候明顯,血瘀證證候積分顯著高于花生油對照組(P0.01)。肝臟腫大,表面暗紫有細(xì)小顆粒,內(nèi)部有小結(jié)節(jié)。HE染色和Masson染色觀察模型大鼠肝組織有明顯纖維化病變。模型大鼠肝指數(shù)、血清肝功能ALT、AST及肝纖維化四項(xiàng)水平高于花生油對照組(P0.05或P0.01)。(2)大鼠原代LSEC的分離、培養(yǎng)及鑒定結(jié)果顯示,采用肝臟膠原酶灌注結(jié)合Percoll密度梯度沉降法及細(xì)胞選擇性貼壁法,分離培養(yǎng)的LSEC生長良好,形態(tài)典型,生長有規(guī)律,從圓形、卵圓形到紡錘形生長轉(zhuǎn)變。掃描電鏡觀察到分離的LSEC表面具有獨(dú)特的窗孔結(jié)構(gòu),多個(gè)窗孔排列成篩板樣結(jié)構(gòu),di-Ac-LDL免疫熒光染色顯示分離培養(yǎng)的LSEC純度較高。(2)莪術(shù)醇治療血瘀證肝纖維化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,莪術(shù)醇能降低模型大鼠血瘀證證候積分、肝指數(shù)、血清肝功能ALT、AST及肝纖維化四項(xiàng)水平(P0.05或P0.01)。HE和Masson染色病理結(jié)果顯示,經(jīng)莪術(shù)醇治療后,模型大鼠肝纖維損傷明顯改善;肝纖維化程度半定量分析結(jié)果顯示,莪術(shù)醇組肝纖維化程度較模型組顯著減輕(P0.05)。掃描電鏡及透射電鏡結(jié)果顯示,莪術(shù)醇能使模型大鼠LSEC窗孔數(shù)量增多,連續(xù)性基底膜消失。ELISA結(jié)果顯示,模型組ET-1蛋白表達(dá)較正常對照組明顯升高(P0.01),莪術(shù)醇能下調(diào)ET-1蛋白表達(dá)(P0.01)。莪術(shù)醇治療血瘀證肝纖維化的療效和陽性對照藥物秋水仙堿和丹參酚酸B療效相近,但莪術(shù)醇和丹參酚酸B改善血瘀證證候體征比秋水仙堿明顯,莪術(shù)醇增加肝組織LSEC窗孔數(shù)量和直徑比丹參酚酸B和秋水仙堿效果顯著。(3)莪術(shù)醇改善LSEC超微結(jié)構(gòu)病變的體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,掃描電鏡及透射電鏡觀察到經(jīng)瘦素誘導(dǎo)激活的LSEC,其窗孔數(shù)量大幅減少甚至消失,窗孔直徑變小,出現(xiàn)“失窗孔化”現(xiàn)象。經(jīng)莪術(shù)醇治療后,與瘦素激活模型組比較,其窗孔數(shù)量明顯增多,窗孔變大。結(jié)論:莪術(shù)醇能明顯改善血瘀型肝纖維化病變,其機(jī)制可能與下調(diào)ET-1蛋白表達(dá)及逆轉(zhuǎn)肝竇毛細(xì)血管化有關(guān)。莪術(shù)醇在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均能減輕LSEC“失窗孔化”等超微結(jié)構(gòu)改變。這將為肝纖維化的防治提供重要參考價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

各組大鼠肝指數(shù)（%）

血瘀證模型組血瘀證體征表1-4大鼠血瘀證證候級別評分結(jié)果（±s，n=10）

大鼠血瘀證證候級別評分結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2788975