【摘要】：樹舌[Ganoderma lipsiense(Batch)G.F.Atk,.Syn.G.applanatum(pers.)Pat.;Elfvingia applanate(Pers.)Karst.]又名“平蓋芝”、“扁靈芝”,屬靈芝科靈芝屬真菌,其全國分布廣泛;其性平,味微苦,在中醫(yī)中已有幾千年的藥用歷史。樹舌子實體多糖是樹舌的重要活性成分,具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物活性,但在其抗腫瘤機(jī)制方面的深入研究不多,本論文主要通過四部分試驗研究以期闡明樹舌子實體多糖的抗腫瘤機(jī)制及抗腫瘤過程中的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。一:樹舌子實體多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表征響應(yīng)面法和單因素試驗對樹舌子實體粗多糖的熱水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化;所得樹舌子實體粗多糖通過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephacyral S-300 HR凝膠柱層析繼續(xù)純化,得到多糖GAP-3S,高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析GAP-3S的分子量,高效液相(HPLC)分析GAP-3S的單糖組成,并對GAP-3S進(jìn)行紅外光譜分析。結(jié)果:單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化樹舌子實體粗多糖的熱水浸提工藝條件:液料比43(mL/g)、提取時間4.5 h、提取溫度100℃,在此工藝參數(shù)下樹舌子實體多糖的提取率為5.03%;純化后所得樹舌子實體多糖GAP-3S的分子量為6.82?10~5 Da,主要由葡萄糖(60.1%)、半乳糖(22.1%)、巖藻糖(9.3%)和木糖(8.5%)組成;紅外光譜分析顯示,GAP-3S含有β-呋喃糖等結(jié)構(gòu)。二:GAP-3S對MCF-7細(xì)胞的作用不同濃度GAP-3S(0,125,250,500μg/mL)處理MCF-7細(xì)胞后,通過MTT法測定MCF-7細(xì)胞的增殖率;PI單染、Hoechst 33258、Annexin V-FITC/PI雙染等確定GAP-3S對MCF-7細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的影響;熒光定量PCR測定凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平;Western Blotting測定MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平;試劑盒檢測Caspase-3、-8、-9蛋白活性。結(jié)果:GAP-3S能夠以劑量及時間依賴的方式抑制MCF-7細(xì)胞的增殖;Hoechst 33258染色法、結(jié)晶紫染色法觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移率等一系列形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明,GAP-3S能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、邊緣羽化及遷移能力下降,同時能使MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期周期阻滯、增加MCF-7細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例;熒光定量PCP和Western Blotting結(jié)果表明GAP-3S能夠顯著上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白P53、P21、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9和Cleved-PARP蛋白表達(dá)量,從基因和蛋白水平確定GAP-3S能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡;GAP-3S同樣能夠增加Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,與上述蛋白表達(dá)測定結(jié)果一致,但Caspase-8活性無明顯變化,表明線粒體凋亡途徑可能在GAP-3S誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。三:GAP-3S誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制試劑盒測定不同濃度GAP-3S(0,125,250,500μg/mL)處理MCF-7細(xì)胞后,MCF-7細(xì)胞的ROS含量、Ca~(2+)濃度、線粒體跨膜電位、抗氧化酶活性的變化;Western Blotting分析GAP-3S對MCF-7細(xì)胞Bax、Bcl-2、胞漿和線粒體中Cyt-C蛋白表達(dá)水平的影響;實時熒光定量PCR測定Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:GAP-3S能夠破壞MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位,增加MCF-7細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及ROS含量;增加抗氧化酶SOD、GPx活性,抗氧化劑GSH含量上升;GAP-3S能夠顯著增加促凋亡蛋白Bax的mRNA和蛋白表達(dá)量,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量,同時GAP-3S能夠影響MCF-7細(xì)胞中Cyt-C亞細(xì)胞定位,促進(jìn)Cyt-C由線粒體向胞漿中的釋放;以上結(jié)果提示,線粒體凋亡途徑在GAP-3S誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡過程中扮演重要作用。四:GAP-3S對MCF-7細(xì)胞MAPK及NF-κB信號通路的影響試劑盒檢測GAP-3S處理MCF-7細(xì)胞后NF-κB核移位情況;Western Blotting檢測IκB、P38、JNK、ERK及p-IκB、p-P38、p-JNK、p-ERK的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:GAP-3S能夠增加MAPKs家族與炎癥和凋亡相關(guān)成員P38、JNK的磷酸化水平,降低與增殖分化相關(guān)成員ERK的磷酸化水平,表明MAPKs在GAP-3S刺激MCFP-7細(xì)胞后胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用;GAP-3S能夠增加IκB蛋白的磷酸化水平,促進(jìn)p65蛋白的核移位,從而激活NF-κB信號通路,表明NF-κB信號通路同樣參與了GAP-3S刺激MCF-7細(xì)胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。綜上所述,樹舌子實體多糖GAP-3S作用MCF-7細(xì)胞后,能夠刺激MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng),MCF-7細(xì)胞內(nèi)MAPKs家族被活化,將GAP-3S的胞外刺激級聯(lián)放大傳遞至胞內(nèi),NF-κB接收到上游MAPKs信號后繼續(xù)將刺激信號傳遞至核內(nèi),從而啟動刺激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,活化線粒體途徑,啟動細(xì)胞程序性死亡,最終執(zhí)行細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

增加巨噬細(xì)胞吞噬活性，延緩腫瘤生長[61]。從可食用平菇子實體中提取的多列腺癌細(xì)胞凋亡，并抑制人乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[62]。毛木耳多糖[63]對幾胞系同樣具有很好的增殖抑制作用。對于上述絕大多數(shù)真菌葡聚糖多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性可能是涉及特異細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞相互作用的結(jié)果，從而白增加、吞噬作用的增加及細(xì)胞因子的分泌（如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子到免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。A

定8]測定 GAP 總糖含量制：一定量的葡萄糖置于 105℃烘箱中干燥至恒重以置成 100 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取 0、0.2、0中，加蒸餾水補(bǔ)至 2 ml，每只試管中加入 1.0 mL 6%溫冷卻，分光光度計（λ490）測定。以葡萄糖含量準(zhǔn)曲線。如圖 2.1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.0074x 測定：配置一定濃度 GAP 樣品溶液，取 0.5mL 按上品中總糖含量。

圖 2.2 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2.2 The standard curve of determination of reducing suga測定苯法[129]測定 GAP 中糖醛酸含量：溶液 1（1.50 mg/mL 間羥基聯(lián)苯溶液）：15 mg 間羥 2（0.0125 mol/L 四硼酸鈉-濃硫酸溶液）：0.476 g 四60 μg/mL 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液）：15 mg 半乳糖醛酸制：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4，冰水浴中向各管加入 3 mL 溶液 2，漩渦震蕩，沸。再向各管中加入 50 μL 溶液 1，混勻后，520 nm 處( μg )為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。如x + 0.0135，R2=0.9946。制一定濃度 GAP 溶液，一般稀釋 2~3 個濃度，取 G OD 值，帶入回歸方程，得樣品中半乳糖醛酸含量。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 白云鵬;嚴(yán)仲鎧;;樹舌及其易混品的生藥鑒別[J];中草藥;1990年02期

2 張中北;楊顏銘;王麗娜;吳波;王宇;宋慧;;羅丹明B標(biāo)記樹舌多糖的條件[J];菌物研究;2016年04期

3 殷培峰;;瑯琊山樹舌多糖的抑菌及抗氧化性研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年36期

4 李榮輝;梁啟超;魏韜;徐明鑫;金紅;;樹舌多糖抗腫瘤的研究進(jìn)展[J];微量元素與健康研究;2012年04期

5 周忠波;馬紅霞;圖力古爾;;樹舌靈芝中3種化學(xué)成分的分離與鑒定[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2008年06期

6 李忠譜;野生活樹樹舌與栽培靈芝藥效比較研究[J];中國食用菌;1994年02期

7 馬曉莉;樹舌及其偽品的凝膠電泳鑒別[J];河北職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1995年04期

8 陳剛,李毅,董林;樹舌研究應(yīng)用概況[J];華西藥學(xué)雜志;1993年01期

9 甄殿魁;樹舌多糖(GAPS)對人扁桃體細(xì)胞的干擾素誘生的影響[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1989年02期

10 岳文杰,衣欣;樹舌子實體多糖對小白鼠缺氧耐力影響的實驗觀察[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1989年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李忠譜;;野生活樹樹舌與栽培靈芝藥效比較研究[A];中國自然資源學(xué)會全國第二屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會論文集[C];1997年

2 劉海良;宋愛榮;黃芳;;樹舌靈芝MP-01菌株發(fā)酵液靈芝酸的提取及測定[A];2008全國藥用真菌學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 于英君;李麗陽;宋高臣;管宇;;樹舌多糖GF注射液對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用[A];2007年全國生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

4 于英君;劉春玲;;重組siRNA/CDK2對HO-8910抑制及樹舌多糖GF協(xié)同作用的研究[A];現(xiàn)代化中藥制劑發(fā)展與中藥藥理學(xué)研究交流會論文集[C];2009年

5 姚陸;朱麗萍;徐曉燕;Martin Sadilek;范寰;胡泊;楊潔;喬斌;楊松;;云芝和樹舌靈芝共培養(yǎng)挖掘新穎次生代謝產(chǎn)物[A];中國菌物學(xué)會2016年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2016年

6 羅文;袁佳妮;韓俐瑩;楊曉;丁雷;周曉東;劉麗文;;新型載樹舌多糖長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體-C3H8微泡復(fù)合體制備的初步研究[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第十二屆全國腹部超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2018年

7 于英君;宋高臣;;RNAi沉寂肝癌細(xì)胞CDK2基因表達(dá)及樹舌多糖GF輔助作用的研究[A];東北三省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)交流會論文摘要[C];2008年

8 于英君;宋高臣;;RNAi沉寂肝癌細(xì)胞CDK2基因表達(dá)及樹舌多糖GF輔助作用的研究[A];中醫(yī)藥生物化學(xué)與分子生物學(xué)通訊[C];2008年

9 袁佳妮;羅文;韓俐瑩;楊曉;丁雷;周曉東;劉麗文;;乳化-溶劑揮發(fā)法制備樹舌多糖長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的方法研究及質(zhì)量表征[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第十二屆全國腹部超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2018年

10 張凌凌;潘景芝;王琦;;樹舌菌絲體多糖提取工藝研究[A];中國菌物學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前4條

1 曾憲策 羅欣;“樹舌”豈能充“靈芝”[N];醫(yī)藥導(dǎo)報;2006年

2 海南康農(nóng)堂藥用植物研究所高級農(nóng)藝師 陳康林;全面科學(xué)認(rèn)識靈芝[N];科技日報;2003年

3 ;全面科學(xué)認(rèn)識靈芝[N];中國信息報;2003年

4 收集整理 軍野;從學(xué)科的角度認(rèn)識靈芝[N];世界報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 甄東;樹舌子實體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 焦連慶;樹舌多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2010年

3 于曉光;纖粘連蛋白誘導(dǎo)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制及樹舌多糖（GF）抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的實驗研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2003年

4 于赫;樹舌多糖GF對小鼠HepA瘤細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)組及核蛋白MDM-2表達(dá)的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2006年

5 宋高臣;RNAi沉寂肝癌細(xì)胞CDK2基因表達(dá)及樹舌多糖GF輔助作用的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 段作文;樹舌靈芝FIP在畢赤酵母中的優(yōu)化表達(dá)及與赤靈芝、紫芝FIP的比較[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 楊顏銘;樹舌多糖雙向免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 林倩倩;樹舌靈芝深層發(fā)酵及三萜類化合物的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 胡靜;樹舌液體深層發(fā)酵浸膏多糖聯(lián)合用藥減毒增效作用研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 孫秋芳;樹舌靈芝發(fā)酵條件的優(yōu)化及發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的研究[D];廣西師范大學(xué);2011年

6 崔太浩;樹舌多糖抗實驗性胃潰瘍作用及其作用機(jī)制研究[D];延邊大學(xué);2008年

7 馬述清;樹舌靈芝部分提取物的分離及其藥理活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 周忠波;樹舌靈芝化學(xué)成分及體外抗腫瘤活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 王再林;幾種真菌多糖熒光標(biāo)記的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 劉英杰;樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號：2788570