【摘要】：目的:以高脂血癥痰濁證大鼠為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)探討化痰降濁方及其拆方干預(yù)高脂血癥痰濁證的作用機(jī)制,從糖代謝、脂代謝、炎癥介質(zhì)方面研究化痰降濁方調(diào)控高脂血癥痰濁證的作用靶點(diǎn)。方法:(一)高脂血癥痰濁證大鼠動(dòng)物模型的復(fù)制、給藥及評(píng)價(jià)將150只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組10只和模型組140只,分別用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)30天后,檢測(cè)所有大鼠的血脂四項(xiàng),評(píng)價(jià)模型的建立情況。再將模型組按血清TC值隨機(jī)分為病證對(duì)照組、西藥對(duì)照組、全方低中高劑量組、蒼術(shù)-白術(shù)低中高劑量組、陳皮-半夏低中高劑量組和茯苓-澤瀉低中高劑量組。按相應(yīng)的給藥方案給藥4周后,取血檢測(cè)血脂四項(xiàng),評(píng)價(jià)各組干預(yù)后的效應(yīng)。(二)“化痰降濁方”的作用機(jī)制研究取正常對(duì)照組、病證對(duì)照組、西藥對(duì)照組以及全方和拆方高劑量組大鼠的肝臟組織,提取mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序,篩選差異表達(dá)基因,研究化痰降濁方及其拆方對(duì)高脂血癥痰濁證的作用機(jī)制。結(jié)果:(一)高脂血癥痰濁證大鼠病證結(jié)合動(dòng)物模型的復(fù)制150只雄性SD大鼠造模30天后,模型組TC和TG水平升高,HDL-C水平降低,與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),符合混合型高脂血癥動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn),提示成功復(fù)制混合型高脂血癥動(dòng)物模型。隨機(jī)分組后病證對(duì)照組與各給藥組間血脂四項(xiàng)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示給藥前各組間血脂水平基線一致,具有可比性。給藥4周后,病證對(duì)照組的TC、LDL-C升高,與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);病證對(duì)照組大鼠的“痰濁證”指標(biāo):體重、肝臟濕重、肝系數(shù)和Lee’s指數(shù)(肥胖程度)均升高,與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。綜合血脂水平和“痰濁證”指標(biāo),可認(rèn)為成功復(fù)制高脂血癥痰濁證病證結(jié)合動(dòng)物模型。(二)化痰降濁方及其拆方的干預(yù)效應(yīng)1.降血脂結(jié)果給藥4周后,大鼠TC水平:西藥組、全方高劑量組、陳皮-半夏低劑量組、茯苓-澤瀉高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);TG水平:蒼術(shù)-白術(shù)高劑量組和茯苓-澤瀉高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);HDL-C水平:蒼術(shù)-白術(shù)中劑量組和茯苓-澤瀉高劑量組升高,與病證對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)《輔助降血脂功能評(píng)價(jià)方法》,判定化痰降濁方為輔助降低血清膽固醇功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,茯苓-澤瀉為輔助降低血脂功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,西藥、陳皮-半夏為輔助降低血清膽固醇功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,蒼術(shù)-白術(shù)為輔助降低血清甘油三酯功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。2.其他指標(biāo)(1)體重:蒼術(shù)-白術(shù)高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)體長(zhǎng):蒼術(shù)-白術(shù)低、中劑量組、陳皮-半夏低劑量組和全方中劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)肝臟濕重:全方高劑量組、陳皮-半夏高劑量組和茯苓-澤瀉高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(4)肝系數(shù):全方高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(5)Lee’s指數(shù):蒼術(shù)-白術(shù)高劑量組降低,與病證對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以上結(jié)果表明,化痰降濁方及其拆方具有較好的控制大鼠血脂水平的作用,尤其以茯苓-澤瀉降血脂效果最好。(三)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果1.各組大鼠肝臟樣品提取的RNA及構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn),測(cè)序得到的Reads與參考基因組的比對(duì)效率較高(73.76%~83.81%)。2.差異基因篩選結(jié)果根據(jù)篩選指標(biāo):FC(Fold Change)≥1.5和FDR(False Discovery Rate)0.05,病證對(duì)照組mRNA與正常對(duì)照組比較,上調(diào)1704個(gè),下調(diào)798個(gè);各給藥組mRNA與病證對(duì)照組比較:西藥組下調(diào)4個(gè);全方組上調(diào)1088個(gè),下調(diào)848個(gè);蒼術(shù)-白術(shù)組上調(diào)10個(gè),下調(diào)11個(gè);陳皮-半夏組上調(diào)103個(gè),下調(diào)275個(gè);茯苓-澤瀉組上調(diào)434個(gè),下調(diào)776個(gè)。3.糖代謝調(diào)節(jié)作用(1)化痰降濁方可通過(guò)激活Ldha、Insr和抑制Aldh1b1、Gck、Uap1l1、Ldhd、Pklr、Srebf1、Cblc和Abcc8的表達(dá)調(diào)節(jié)糖代謝,涉及戊糖與葡萄糖醛酸酯互變、半乳糖代謝、抗壞血酸鹽和醛糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙酮酸代謝、丙酸代謝、AMPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和胰島素分泌10條通路;(2)茯苓-澤瀉可通過(guò)抑制Pfkp、G6pd、Aldh1b1、Akr1b1、Hk2、Hk3、Nagk、Gnpda1、Pkm、Ldhb、Me2、Ldhd、Pklr、Oxct1、Pik3cg、Pip4k2a、Pik3cd、Inpp5d、Synj2、Plcg2、Pik3r5、Scd2、Cblc、Slc2a1、Camk2d、Prkcb和Kcnn4的表達(dá)調(diào)節(jié)糖代謝,涉及戊糖磷酸途徑、戊糖與葡萄糖醛酸酯互變、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、抗壞血酸鹽和醛糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙酮酸代謝、丙酸代謝、丁酸酯代謝、磷酸肌醇代謝、AMPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和胰島素分泌14條通路;(3)陳皮-半夏可通過(guò)激活I(lǐng)nsr和抑制Aldh1b1、Pkm、Me2、Pklr、Pik3cd、Srebf1、Scd2、Cblc的表達(dá)調(diào)節(jié)糖代謝,涉及戊糖與葡萄糖醛酸酯互變、抗壞血酸鹽和醛糖代謝、丙酮酸代謝、磷酸肌醇代謝、AMPK信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路6條通路;(4)蒼術(shù)-白術(shù)可通過(guò)抑制Aldh1b1的表達(dá)調(diào)節(jié)糖代謝,涉及戊糖與葡萄糖醛酸酯互變、抗壞血酸鹽和醛糖代謝和丙酮酸代謝3條通路。(5)糖代謝小結(jié):全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表達(dá);另外,全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Pklr、Cblc的表達(dá);全方和茯苓-澤瀉均能抑制Ldhd的表達(dá);全方和陳皮-半夏均能激活I(lǐng)nsr的表達(dá),抑制Srebf1的表達(dá)。4.脂代謝調(diào)節(jié)作用(1)西藥阿托伐他汀可通過(guò)抑制Pla2g2d的表達(dá)調(diào)節(jié)脂代謝,涉及甘油磷脂代謝、醚酯代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝和α-亞油酸代謝5條通路;(2)化痰降濁方可通過(guò)激活A(yù)cot2、Acot3、Acox1、Dhcr24、Lss、Cyp3a9、Pnpla7、Ptdss2、Ept1、Cyp4a1、Cyp4b1和抑制Cyp7a1、Aldh1b1、Chka、Asah2的表達(dá)調(diào)節(jié)脂代謝,涉及脂肪酸延長(zhǎng)、脂肪酸代謝、類(lèi)固醇生物合成、初級(jí)膽汁酸合成、甾類(lèi)激素合成、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、醚酯代謝、鞘脂類(lèi)代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、不飽和脂肪酸合成、PPAR信號(hào)通路14條通路;(3)茯苓-澤瀉可通過(guò)激活A(yù)cot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7、Ept1和抑制Ppt1、Ppt2、Scd2、Cyp7a1、Cyp7b1、Aldh1b1、Akr1b1、Pla2g4a、Lpcat2、Pla2g2d、Pla2g16、Pld4、Asah2、Hpgds、Ptgs1、Tbxas1、Olr1的表達(dá)調(diào)節(jié)脂代謝,涉及脂肪酸延長(zhǎng)、脂肪酸代謝、類(lèi)固醇生物合成、初級(jí)膽汁酸合成、甾類(lèi)激素合成、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、醚酯代謝、鞘脂類(lèi)代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、不飽和脂肪酸合成、PPAR信號(hào)通路14條通路;(4)陳皮-半夏可通過(guò)激活A(yù)cox1、Cyp2b1、Ept1、Cyp4b1和抑制Scd2、Cyp7b1、Aldh1b1、Pla2g16、Pla2g7、Pltp的表達(dá)調(diào)節(jié)脂代謝,涉及脂肪酸代謝、初級(jí)膽汁酸合成、甾類(lèi)激素合成、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、醚酯代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、不飽和脂肪酸合成、PPAR信號(hào)通路11條通路;(5)蒼術(shù)-白術(shù)可通過(guò)抑制Aldh1b1、Pla2g2d,涉及甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、醚酯代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝和α-亞油酸代謝6條通路。(6)脂代謝小結(jié):全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表達(dá);另外,全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Ept1的表達(dá);全方和茯苓-澤瀉均能激活A(yù)cot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7的表達(dá),抑制Cyp7a1、Asah2的表達(dá);全方和陳皮-半夏均能激活A(yù)cox1、Cyp4b1的表達(dá)。5.炎癥介質(zhì)通路調(diào)節(jié)作用(1)化痰降濁方可通過(guò)抑制Cblc、Cdc25b的表達(dá)減少炎癥反應(yīng),涉及Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路2條通路;(2)茯苓-澤瀉可通過(guò)抑制Pim1、Il3ra、Ifngr2、Il2rg、Pik3cg、Stat1、Ptpn6、Il21r、Il10ra、Pik3cd、Jak3、Il15ra、Cblc、Pik3r5、Cish、Il2rb、Csf2ra、Crlf2、Pla2g4a、Dusp10、Rasgrp1、Ptpn7、Rac2、Prkcb、Dusp5、Stmn1、Fas、Nfkb2、Jund、Map4k1、Tgfb1、Pak1、Relb、Rras、Flna、Birc3、Nfkbia、Lyn、Lck、Ccl4、Syk、Ccl19、Zap70、Cd40、Ccl21、Bcl2a1、Traf1、Tnfaip3、Plcg2、Btk的表達(dá)減少炎癥反應(yīng),涉及Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路3條通路;(3)陳皮-半夏可通過(guò)抑制Il2rg、Pik3cd、Cblc、Il2rb、Csf2ra、Stmn1、Map4k1、Pak1、Lck、Syk、Zap70、Ccl21、Bcl2a1的表達(dá)減少炎癥反應(yīng),涉及Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路3條通路。(4)炎癥介質(zhì)小結(jié):全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Cblc的表達(dá)。6.Q-PCR驗(yàn)證結(jié)果選擇調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因:CYP7A1、LXRα、PPARγ和SREBP1-c做Q-PCR驗(yàn)證�；到禎岱浇M和茯苓-澤瀉組四個(gè)基因的表達(dá)量均降低,和病證對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);蒼術(shù)-白術(shù)組SREBP1-c基因表達(dá)量降低,和病證對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。結(jié)論:(一)用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠30天能成功復(fù)制高脂血癥痰濁證病證結(jié)合動(dòng)物模型,化痰降濁方及其拆方均能有效控制高脂血癥痰濁證大鼠的血脂水平,效果與西藥相當(dāng)。方中的茯苓-澤瀉在降血脂方面效果最好。(二)初步揭示了化痰降濁方的作用機(jī)制1.在調(diào)節(jié)糖代謝方面:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表達(dá);另外,全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Pklr、Cblc的表達(dá);全方和茯苓-澤瀉均能抑制Ldhd的表達(dá);全方和陳皮-半夏均能激活I(lǐng)nsr的表達(dá),抑制Srebf1的表達(dá)。2.在調(diào)節(jié)脂代謝方面:全方和拆方均能抑制Aldh1b1的表達(dá);另外,全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Ept1的表達(dá);全方和茯苓-澤瀉均能激活A(yù)cot2、Acot3、Dhcr24、Cyp3a9、Pnpla7的表達(dá),抑制Cyp7a1、Asah2的表達(dá);全方和陳皮-半夏均能激活A(yù)cox1、Cyp4b1的表達(dá)。3.在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)方面:全方和茯苓-澤瀉、陳皮-半夏均能抑制Cblc的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2788481