【摘要】：背景和目的:本實驗室前期研究已發(fā)現(xiàn),甘草中含有豐富的小分子miRNA,高通量測序發(fā)現(xiàn),miRNA156在甘草中的豐富度位居前位。后經(jīng)體外共培養(yǎng)實驗表明,甘草miRNA對人體免疫細胞的基因表達有一定的調(diào)節(jié)作用;體內(nèi)實驗表明,甘草miRNA對腸道菌和腸道免疫系統(tǒng)也具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究主要是研究甘草miRNA156是如何調(diào)節(jié)小鼠的免疫系統(tǒng),而腸道菌又在其中扮演了怎樣的角色。方法:1.體外實驗:NCBI檢測甘草miRNA156 mimic序列靶點細菌,培養(yǎng)后分別和miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor共培養(yǎng),通過檢測OD600觀察生長曲線的變化。2.體內(nèi)實驗:將BALB/C小鼠隨機分為6組,組內(nèi)分為灌胃組和同籠組,其中6組分別灌胃甘草水提物(1.5g/kg)、甘草酸(0.375g/kg)、miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor,另外6組分別與上述6組同籠喂養(yǎng),喂養(yǎng)7天后收集糞便進行16SV3-V4區(qū)測序,分析各組腸道微生物的改變。3.取小鼠回腸組織和結(jié)腸組織,一部分回腸液氮脫水,加Trizol研磨提取RNA后用于轉(zhuǎn)錄組測序,分析差異基因,一部分回腸和結(jié)腸在4%多聚甲醛固定后,切片石蠟包埋,HE染色,顯微鏡下拍照分析各組腸道切片之間的差異。4.取小鼠脾臟,提取RNA后RT-QPCR驗證差異基因在脾臟中的表達情況。結(jié)果:1.檢測到miRNA156靶向鮑曼不動桿菌,大腸桿菌作為對照,將鮑曼不動桿菌與大腸桿菌分別測定自由生長條件下的生長曲線,并測定鮑曼不動桿菌與大腸桿菌分別與miRNA156 mimic、miRNA156mutant、miRNA156 inhibitor共培養(yǎng)至平臺期的生長曲線,由生長曲線可見miRNA156 mimic對鮑曼不動桿菌的生長有調(diào)節(jié)作用,大腸桿菌共培養(yǎng)則沒有發(fā)現(xiàn)差異。2.糞便16S測序結(jié)果表明,甘草水提物組、甘草酸組、miRNA156mimic組的灌胃組與同籠組腸道菌群趨于一致,在miRNA156 mimic組的灌胃組與同籠組中發(fā)現(xiàn),乳酸菌群含量大幅度增多,而miRNA156mutant、miRNA156 inhibitor灌胃組和同籠組中乳酸菌含量顯著性降低。3.回腸轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,甘草水提物灌胃組、甘草酸灌胃組和miRNA156 mimic灌胃組免疫相關(guān)信號通路富集,而miRNA156mutant灌胃組和miRNA156 inhibitor灌胃組并沒有大量的免疫相關(guān)信號通路出現(xiàn)差異,甘草水提物灌胃組與同籠組腸道通路富集情況明顯不同,而miRNA156 mimic灌胃組和同籠組腸道結(jié)果趨于一致,都是免疫相關(guān)通路富集;比較回腸和結(jié)腸的HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),miRNA156mimic組腸道結(jié)構(gòu)較完整,甘草水提物組和甘草酸組有局部輕微水腫,而miRNA156 mutant組和miRNA156 inhibitor組出現(xiàn)少量腸腺壞死和局部水腫,各組同籠組與灌胃組病理情況趨于一致,miRNA156 mimic灌胃組和同籠組腸道狀態(tài)明顯呈現(xiàn)良好狀態(tài)。甘草水提物灌胃組和miRNA156 mimic灌胃組腸道狀態(tài)趨近,而甘草水提物同籠組與灌胃組差異較明顯,miRNA156 mimic灌胃組與同籠組腸道狀態(tài)也趨于一致,說明甘草miRNA156是甘草水提物的有效成分,并且miRNA156可以通過腸道菌影響小鼠腸道免疫。4.脾臟驗證結(jié)果表明,灌胃甘草miRNA156不僅會影響小鼠腸道免疫,也會對脾臟免疫系統(tǒng)造成一定的影響,說明灌胃甘草miRNA156對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的影響是全身性的,不是局限性的。結(jié)論:通過糞便16S測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃組和同籠組在共培養(yǎng)的條件下,腸道菌趨于一致,且miRNA156 mimic組腸道有益菌明顯增多;通過腸道轉(zhuǎn)錄組結(jié)果和腸道病理切片結(jié)果說明甘草水提物中有效成分不僅有甘草酸,也有miRNA156,甘草miRNA156通過對腸道菌的調(diào)節(jié),改善小鼠腸道免疫,甚至影響小鼠脾臟免疫基因表達水平。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1-1 NCBI 網(wǎng)站比對序列結(jié)果Fig.1-1 The results of alignment sequence in NCBI website1.4.2 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌生長曲線通過測定 OD600，繪制大腸桿菌和鮑曼不動桿菌的生長曲線，如圖 1-2 所示。

圖 1-2 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌生長曲線（a.大腸桿菌；b.鮑曼不動桿菌）Fig 1-2 Growth curves of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii (a. Escherichia coli; b.Acinetobacter baumannii)1.4.3 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌共培養(yǎng)生長曲線圖 1-3 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌共培養(yǎng)生長曲線（a.大腸桿菌；b.鮑曼不動桿菌,*p＜0.05）

13圖 1-3 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌共培養(yǎng)生長曲線（a.大腸桿菌；b.鮑曼不動桿菌,*p＜0.05）Fig 1-3 Co-culture growth curve of E. coli and Acinetobacter baumannii (a. E. coli; b.Acinetobacter baumannii，*p＜0.05)分別測定大腸桿菌和鮑曼不動桿菌與 miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 共培養(yǎng)后的 OD600 值，繪制得生長曲線，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 三者共培養(yǎng)后細菌生長沒有發(fā)生變化；而鮑曼不動桿菌與 miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 三者共培養(yǎng)后，鮑曼不動桿菌和 miRNA156 mimic 組 OD600

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本文編號：2785303