【摘要】：樺褐孔菌(Ionotus obliquus)是一種天然的藥用真菌,已經(jīng)被廣泛研究開發(fā)并應(yīng)用于藥品和食品的研究中。該藥用真菌中化學(xué)成分類型豐富,如三萜、甾類、多酚、多糖等,其中三萜類成分具有極其顯著的抗腫瘤等藥理活性。目前,國內(nèi)外對樺褐孔菌中三萜成分提取分離工藝的文獻報道較少,均采用傳統(tǒng)的有機溶劑提取與柱層析分離獲得三萜化合物單體,存在操作繁瑣、費時費力等缺點。本實驗率先采用酶誘導(dǎo)結(jié)合負壓空化提取技術(shù)對樺褐孔菌中的三萜化合物進行了高效的提取,并利用大孔吸附樹脂對樺褐孔菌中的三萜化合物進行了有效的富集,最后利用高速逆流色譜對三萜化合物單體成分進行了分離純化,得到4種三萜化合物單體。本研究系統(tǒng)地建立了一套對樺褐孔菌中三萜化合物的高效提取分離新工藝,為樺褐孔菌資源的深度開發(fā)利用提供了科學(xué)基礎(chǔ),并具有重要的應(yīng)用潛力。本論文的研究結(jié)果如下:1.采用單因素實驗和Box-Behnken(BBD)實驗設(shè)計對酶誘導(dǎo)結(jié)合負壓空化方法提取樺褐孔菌中三萜化合物的工藝參數(shù)進行考察以及優(yōu)化,確定最優(yōu)的提取工藝參數(shù):酶種類:纖維素酶酶濃度:1 mg/mL誘導(dǎo)溫度:40℃誘導(dǎo)時間:24 h在最佳酶誘導(dǎo)條件下進行了實驗,誘導(dǎo)后的樺褐孔菌粉末中三萜化合物的含量為16.35 mg/g,比未經(jīng)酶誘導(dǎo)的樺褐孔菌中三萜化合物的含量提高了 28.13%。提取溶劑:75%乙醇溶液提取壓力:-0.08 Mpa液固比:16提取溫度:43℃提取時間:30 min在上述優(yōu)化條件下進行了實驗,對經(jīng)酶誘導(dǎo)得到的樺褐孔菌粉末進行了提取,三萜化合物的提取率為17.41mg/g(n=3),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)是0.85%。2.采用大孔吸附樹脂對樺褐孔菌粗提物中的三萜化合物進行富集純化,確定了最優(yōu)的工藝條件:樹脂類型:AB-8樣晶體積:8/3 BV樣品濃度:1 mg/mL上樣流速:1 BV/h除雜解吸液濃度:60%乙醇溶液除雜解吸液體積:3 BV洗脫解吸液濃度:90%乙醇溶液洗脫解吸液體積:4.5 BV在上述優(yōu)化條件下,得到三萜化合物的回收率為85.92%,含量達53.26%,是富集前的4.67倍。3.利用高速逆流色譜對樺褐孔菌中三萜化合物進行分離,優(yōu)化得到了最優(yōu)條件參數(shù):分離溶劑體系:正己烷-乙腈(1:1;v/v)固定相:上相流動相:下相溫度:25 ℃主機轉(zhuǎn)速:800 rpm流動相流速:1 mL/min在上述優(yōu)化條件下,經(jīng)過一次等梯度的分離,在5小時內(nèi)得到4個化合物,包括3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、樺褐孔菌醇、羊毛甾醇,得率分別為0.10 mg/g、0.13 mg/g、0.35 mg/g、0.17 mg/g,回收率分別為 93.1%、95.2%、97.8%、98.1%,純度均在95%以上。綜上所述,本論文利用酶誘導(dǎo)結(jié)合負壓空化提取三萜化合物的得率為17.41mg/g,大孔吸附樹脂富集三萜化合物含量為53.26%,并利用高速逆流色譜分離得到3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、樺褐孔菌醇、羊毛甾醇四種三萜化合物單體。本研究獲得了一種高效、快速、可靠的樺褐孔菌中三萜化合物的提取、富集以及分離純化的新工藝,同時為其他植物資源中的次生代謝產(chǎn)物的制備利用提供了有效的技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284
【圖文】：

２．２．１標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制逡逑利用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度繪制橫坐標(biāo)，對應(yīng)的溶液的吸光度繪制縱坐標(biāo)，得到總?cè)坪垮义蠝y定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖２－２。逡逑ｙ邋＝邋０－．７４５邋ｌｘ邋－邋０．０５２逡逑１６邋．邐Ｒｉ邋＝邋０．９９９１逡逑１．４逡逑ｍ邋ｉ邋■逡逑＆邋０－８逡逑０．６逡逑０．４逡逑０＊２邋－逡逑Ｑ邋＾邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐｜逡逑０邐ＯＳ邐１邐１．５邐２邐２．５逡逑濃度（ｍｇ／ｍＬ〉逡逑圖２－２總?cè)坪繙y定的標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｃｏｎｔｅｎｔ逡逑該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為ｙ邋＝邋０．７４５１ｘ邋＋邋０．０５２，邋Ｒ２邋＝邋０．９９９１，說明在０－ｌｍｇ的范圍中，逡逑三萜化合物和其吸光度值線性關(guān)系良好。逡逑２．２．２提取工藝條件的單因素優(yōu)化逡逑２．２．２．１不同種類的酶誘導(dǎo)對樺褐孔菌提取物中三萜含量的影響逡逑－１４－逡逑

逑樺褐孔菌經(jīng)相同濃度的纖維素酶、Ｐ■葡萄糖苷酶和果膠酶的處理后，對提取物中逡逑三萜化合物含量進行了檢測，并與未經(jīng)酶處理的提取物進行了對比，結(jié)果見圖２－３�？慑义弦钥闯�，經(jīng)過酶處理的提取物中三萜化合物含量都高于對照組含量，并且經(jīng)纖維素酶和逡逑Ｐ－葡萄糖苷酶處理所得提取物的三萜含量明顯高于經(jīng)果膠酶處理的含量�？赡茉蚴窃阱义咸幚磉^程中，酶作用于細胞壁，使細胞壁遭到破壞，化學(xué)成分可以更高效地溶出。綜合逡逑對經(jīng)濟成本的影響，纖維素酶較為低廉，被應(yīng)用于對樺褐孔菌材料進行酶誘導(dǎo)處理。逡逑１６邋ｒ逡逑１４邋ｐｉ－邐ｒ＾￣ｉ邐Ｔ逡逑－１２逡逑Ｍｌ逡逑＇Ｓｏ邋ｌ0逡逑ａ逡逑＾邋８逡逑Ｍ邋＾逡逑＆邋６邋■逡逑？邋４邋－逡逑！逡逑２邋－逡逑ｑ邋邐ｊ邐：邐ｉ邐；邐ｉ邐！邐Ｉ邐ｉ邐：邐ｉ逡逑纖維羞南邐ｐ－葡萄耱苷南邐果膠病邐對照逡逑南神類逡逑圖２－３不同種類的酶對樺褐孔菌三萜化合物含量的影響逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｋｉｎｄｓ邋ｏｆ邋ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｆｒｏｍ邋／．邋ｏｂｌｉｑｕｕｓ逡逑２．２．２．２酶誘導(dǎo)濃度對樺褐孔菌提取物中三萜含量的影響逡逑在選擇酶的種類后，對處理樺褐孔菌材料的纖維素酶的濃度進行了考察，不同濃度逡逑的酶的影響結(jié)果見圖２－４�？梢钥闯�，隨著濃度的增加，樺褐孔菌中三萜化合物的含量逡逑也逐漸增加，至濃度為１邋ｍｇ／ｍＬ時，含量達到了最大值，增加了邋１１．５３％；隨著酶濃度逡逑的繼續(xù)增加，三萜化合物的含量也有所降低�？赡茉蚴沁^多的酶會在植物組織中發(fā)生逡逑了其他的反應(yīng)。因此

ａ＝Ｋ２／Ｋｉ邋（Ｋ２＞Ｋ，）逡逑４．１．４分離實驗過程逡逑高速逆流色譜分離儀器如圖４－１所示。逡逑ｍ邋ｐ邋ｗ邋ｌｌｌｌ邋Ｌ－ＪＪ邋￣Ｗｉ邋＼邋ａ逡逑＿＾邐｜ｆｔｌ邐口邐Ｉ－逡逑Ｎ邐逡逑圖４－ｌ高速逆流色譜儀器示意圖逡逑Ｆｉｇ．４－ｌ邋Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＨＳＣＣＣ逡逑－３１－逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2783918